原發性肝癌高遷移率族蛋白B1表達改變及其機制

王婷婷，韓菲菲，梁加貝，王發龍，陳國千＊

（南京醫科大學附屬無錫人民醫院1.醫學檢驗科；2.病理科，江蘇 無錫214023）

高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）為主要存在于細胞核中的一種非組蛋白，參與核內多種功能。許多種類細胞受誘導因素誘導后可以胞外釋放HMGB1，胞外HMGB1參與介導炎癥反應，并與細胞增殖、細胞分化、細胞遷移等有關［1］。近年研究［2］表明，HMGB1在腫瘤的發生、發展中具有重要作用，但原發性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）組織 HMGB1的表達改變及其血清HMGB1水平檢測和臨床意義研究報道甚少，肝癌細胞HMGB1釋放機制尚未見探討。本文就原發性肝癌HMGB1表達改變及其機制進行初步實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

48例健康對照者為本院體檢人群的健康者，38例慢性乙肝、32例乙肝后肝硬化和23例繼發性肝癌患者來自本院門診和住院部，年齡29－60歲；繼發性肝癌患者的原發癌有胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、膽囊癌、胰腺癌、子宮癌、卵巢癌等。39例PHC患者來自本院住院部，均為初次入院、未經治療者，并經組織病理學證實，年齡32－64歲，其中腫瘤大小＜2cm 14例、≥2cm 25例，TNM分期Ⅰ或Ⅱ期17例、Ⅲ或Ⅳ期22例。人肝癌細胞株SMMC－7721購自中國科學院細胞庫。DMEM高糖培養液為Sigma公司產品。

1.2 HMGB1mRNA表達量檢測

按Trizol試劑說明書提取肝組織或肝細胞中總RNA后進行逆轉錄反應，cDNA產物置－20℃保存。使用ABI－7500熒光定量PCR儀進行擴增，PCR參數為95℃預變性30sec、95℃變性5sec、60℃退火延伸34sec，循環40次。HMGB1引物：F 5’－GATCCCAATGCACCCAAGAG－3’，R 5’－TCGCAACATCACCAATGGAC－3’；GAPDH 引物：F 5’－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3’，R 5 ’－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－3 ’。 以HMGB1和 GAPDH 的 Ct值之差（△Ct）作為HMGB1mRNA相對表達水平的指標。

1.3 細胞培養實驗

SMMC－7721細胞使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液在CO2培養箱中常規培養（37℃，5%CO2、95%空氣），細胞貼壁覆蓋達80%－90%時進行細胞實驗。缺氧組置于YCP－50S三氣培養箱中培養（37℃，5%CO2、1%O2、94%N2），常氧組進行常規培養。各組實驗均重復8次。

1.4 培養上清液HMGB1含量測定

血清或培養上清液中HMGB1含量使用HMGB1ELISA試劑盒（Shino－Test公司）檢測，按產品使用說明書操作。

1.5 統計學分析

使用SPSS 18.0統計軟件包，兩組間均數比較采用雙側Satterthwaite近似法t檢驗或配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩指標變量關系采用Spearman相關系數進行相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PHC患者血清HMGB1水平的改變

健康對照、慢性乙肝、乙肝后肝硬化、繼發性肝癌和PHC各組的血清HMGB1水平分別為3.9±1.4、4.6±1.8、6.3±2.8、17.2±6.7和 13.5±6.3 μg／L，肝病各組血清HMGB1水平升高，尤以繼發性肝癌組和PHC組升高顯著，且繼發性肝癌組高于PHC 組 （P＜0.05），見 圖 1。PHC 組 血 清HMGB1水平與血清甲胎蛋白水平之間具有正相關性（r＝0.614，P＜0.01）。PHC組TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期患者血清 HMGB1水平（16.4±6.4μg／L）明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者（9.7±4.0μg／L）（P＜0.01）。

圖1 肝病患者血清HMGB1水平

2.2 PHC組織中HMGB1基因表達的改變

通過RT－PCR檢測，11例PHC（TNM 分期為Ⅲ、Ⅳ期）組織中 HMGB1mRNA相對表達水平（△Ct）（2.91±0.56）較癌旁組織（4.73±0.95）明顯增強（P＜0.01）。

2.3 缺氧對肝癌細胞HMGB1基因表達和胞外釋放的影響

SMMC－7721細胞經缺氧培養6h后，HMGB1 mRNA表達明顯增強（P＜0.01），并隨時間延長而增強，見圖2；而在常氧培養24h內，HMGB1mRNA表達無顯著性改變。經缺氧培養3h后，培養上清液中HMGB1含量即見時間依賴性升高，見表1。

圖2 缺氧對肝癌細胞HMGB1mRNA表達的影響

表1 缺氧對肝癌細胞培養上清液中HMGB1含量的影響（μg／L，±s）

表1 缺氧對肝癌細胞培養上清液中HMGB1含量的影響（μg／L，±s）

注：／未檢出；與常氧組比較，＊P＜0.01

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3 討論

PHC是最常見的惡性腫瘤之一，尤其在中國，病例數占全球的半數以上。近十多年來，雖然PHC的早期診斷技術和治療手段有了明顯的提高和改善，但PHC患者的預后仍然較差［3］。PHC的發生、發展是一個復雜的生物學過程，其分子機制有待深入研究。HMGB1為一種主要位于細胞核內與DNA非特異性結合、進化高度保守的非組蛋白，分子量約30kDa，參與核內基因轉錄、DNA重組和修復、核小體構建和穩定以及類固醇激素調控等，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中快速遷移而得名［1］。諸多研究［1］表明，許多種類細胞如免疫細胞、內皮細胞、上皮細胞等受胞外誘導因素（如脂多糖、干擾素－γ、生物活性脂、缺氧等）誘導后可主動分泌HMGB1，分泌后的胞外HMGB1參與介導炎癥免疫反應、細胞增殖、細胞分化、細胞遷移等。

近年研究［2］顯示，發生惡性腫瘤時，由于腫瘤細胞基因表達和腫瘤組織微環境的改變，腫瘤組織細胞HMGB1通常表達增強和釋放增多，HMGB1與腫瘤的發生、生長、浸潤和轉移等有著密切關系。Dong等［4］報道，PHC組織中的 HMGB1基因和蛋白表達明顯增強，其表達水平與腫瘤病理學分級、遠處轉移有關；利用shRNA敲除人肝癌細胞株HMGB1基因后，基質金屬蛋白酶－2表達下調，細胞增殖活性和遷移能力下降。Yan等［5］研究結果顯示，PHC組織和細胞HMGB1高表達，HMGB1通過TLR4和RAGE信號通路誘導半胱氨酸蛋白酶－1（caspase－1）活化，后者介導若干炎癥介質產生，并促進腫瘤侵襲和轉移。本研究結果顯示，PHC（TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期）組織中的HMGB1基因表達顯著高于對應的癌旁組織，與以上學者的研究結果一致。肝癌患者血清HMGB1水平的變化及其意義研究較少，Cheng等［5］報道，PHC患者血清HMGB1水平（84.2±50.4ng／ml）高于健康者（7.0±5.9ng／ml），本研究結果顯示，PHC患者血清HMGB1水平（13.5±6.3ng／ml）明顯升高，并與其TNM分期有關，但結果值明顯低于Cheng的報道結果，可能與前者采用蛋白印跡法檢測有關。結果也顯示，繼發性肝癌患者血清HMGB1水平顯著升高，可能與繼發性肝癌患者為晚期癌癥并存在多處腫瘤有關，并提示其它腫瘤組織細胞HMGB1表達或釋放增多。

腫瘤組織HMGB1表達增強的分子機制迄今未見研究報道，本實驗結果表明缺氧狀態對肝癌細胞HMGB1基因表達和胞外釋放有明顯影響。腫瘤組織因細胞增殖過快、血管分布紊亂和結構異常而常處于缺氧微壞境中，我們前期研究［7，8］結果也顯示，缺氧可以誘導巨噬細胞、肺成纖維細胞等HMGB1基因表達和胞外釋放，提示腫瘤組織HMGB1表達增強與其發生的缺氧微壞境有關。

血清HMGB1作為潛在的肝癌標志物值得關注和進一步研究。

［1］Naglova H，Bucova M.HMGB1and its physiological and pathological roles［J］.Bratisl Lek Listy，2012，113（3）：163.

［2］Tang D，Kang R，Zeh HJ 3rd，et al.High－mobility group box 1 and cancer［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1799（1－2）：131.

［3］Tinkle CL，Haas－Kogan D.Hepatocellular carcinoma：natural history，current management，and emerging tools［J］.Biologics，2012，6：207.

［4］Dong YD，Cui L，Peng CH，et al.Expression and clinical significance of HMGB1in human liver cancer：Knockdown inhibits tumor growth and metastasis in vitro and in vivo［J］.Oncol Rep，2013，29（1）：87.

［5］Yan W，Chang Y，Liang X，et al.High－mobility group box 1activates caspase－1and promotes hepatocellular carcinoma invasiveness and metastases［J］.Hepatology，2012，55（6）：1863.

［6］Cheng BQ，Jia CQ，Liu CT，et al.Serum high mobility group box chromosomal protein 1is associated with clinicopathologic features in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Dig Liver Dis，2008，40（6）：446.

［7］劉鴻生，劉 潔，韓菲菲，等.缺氧誘導人肺成纖維細胞釋放高遷移率族蛋白B1［J］.實用醫學雜志，2012，28（6）：868.

［8］李 蕾，韓菲菲，王發龍，等.缺氧對巨噬細胞HMGB1釋放的影響及其機制［J］.中國實驗診斷學，2012，16（5）：761.