納米金免疫層析法定量檢測尿RBP

徐 寬，沈鶴柏，朱龍章

（上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234）

納米金免疫層析法定量檢測尿RBP

徐 寬，沈鶴柏，朱龍章*

（上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234）

應用納米金免疫層析技術（雙抗夾心法）和檸檬酸三鈉還原法建立一種對尿RBP的快速定量檢測方法，并在此基礎上研制出快速檢測試紙條.該試紙條用納米金免疫層析定量分析儀可在15 min內實現RBP定量檢測，檢測限為150μg／L（相當于150 ng／mL），檢測范圍為150～5000μg／L.與尿微量白蛋白（ALB）、轉鐵蛋白（TRF）、β2-微球蛋白（β2-MG）、尿纖維連接蛋白（FN）、溶菌酶（LZM）等腎臟疾病標志物無交叉反應.該方法特異性強、檢測靈敏度高、范圍廣、簡便快捷，在近端腎小管的損傷、糖尿病腎病等腎臟疾病的早期診斷及過程監控中具有較為廣泛的臨床應用.

尿RBP；納米金；免疫層析；定量檢測

0 前 言

視黃醇結合蛋白(Retinol Binding Protein，RBP）是體內一類將VitA從肝臟中轉運至靶組織以及實現VitA細胞內轉運代謝的特異性運載蛋白，在協助VitA發揮生理功能中起著不可替代的作用［1］.研究發現RBP廣泛存在于正常人的體液中，屬于α1-球蛋白［2］.RBP主要以視黃醇和前白蛋白結合的復合物形式存在，當復合物中視黃醇與靶細胞結合后，復合物中的視黃醇結合蛋白便與前白蛋白分離而從腎小球濾出，并由近端腎小管上皮細胞吸收、降解［3］.近年來的深入研究表明，RBP含量的改變能夠敏感地反映近端腎小管的損傷，實現糖尿病、腎病的早期診斷［4］.

彭彥孟等［5］在采用ELISA法對241例腎臟疾病患者的尿RBP進行檢測以探討尿RBP在早期腎小管損傷的診斷價值.實驗發現，腎損傷患者的尿RBP較正常對照組明顯增高；同時，尿RBP在酸性環境中穩定性好且不易被破壞，是反映腎小管受損的敏感指標.王瑞石等［6］在對4種經腎穿刺活檢診斷的腎病患者進行尿RBP的變化與腎小管間質形態學改變之間的關系，以及腎功能對其影響的研究中指出，尿RBP與腎小管間質的形態學改變有良好的相關性，其水平高低直接反應腎小管間質的病變程度.因此，尿RBP是反映近端腎小管功能的特異性標志物，可能對鑒別診斷各種腎臟疾病小管間質病理受損及受損程度具有重要臨床意義.

納米金免疫層析技術(GICA）［7-8］是20世紀90年代以來發展起來的一種將納米生物技術、色譜層析技術和免疫層析技術相結合的固相膜免疫層析方法，并在此基礎上發展成的一種新型體外診斷技術［9］.雖然近年來該方法發展迅速，在生物醫學領域特別是醫學檢驗中得到了廣泛應用，但采用該方法實現對RBP的定量檢測仍未見報道.

目前臨床上對RBP的定量檢測已經成為腎功能檢測的一種有效且成熟的方法，而ELISA法和免疫比濁法是各大醫院目前普遍采用的方法.但這兩種方法耗時長、操作步驟比較繁瑣、對操作人員的專業技術要求較高、所需儀器也較為昂貴等，這給基層醫院對RBP定量檢測的普及造成了不小困難.而本研究采用納米金免疫層析技術，正好在彌補傳統方法的缺陷與不足的同時，還能實現對尿RBP的定量檢測，對近端腎小管的損傷、糖尿病腎病等腎臟類疾病的大規模篩查、早期診斷及過程監控都具有重要影響.

1 材 料

1.1 主要儀器

H01-1B數顯恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；Thermo MμLtiskan Spectrμm多功能酶標儀(Thermo Scientific）；掃描電子顯微鏡SEM(JEM- 2010，JEOL，Japan）；AllegraTM64R臺式高速冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司）；渦旋儀(上海醫科大學設備廠）；激光Nano Zetasizer電位及粒徑測定儀(Malvern公司）；HM3010單維往復式劃膜儀，ZQ-2000微電腦自動斬切機(上海金標生物科技有限公司）；DH-252BS除濕機(杭州川井電器有限公司）；BN-Q2000型納米金免疫層析定量分析儀(上海柏納生物技術有限公司）；真空干燥箱(上海精密儀器儀表有限公司）；純水儀(上海力康公司）.

1.2 主要試劑

鼠抗RBP單克隆抗體(S-64-11）、(S-113-7）(上海中科英沐生物科技有限公司）；RBP標準品(北京西美杰生物有限公司）；二抗(上海捷寧生物科技有限公司）；小牛血清白蛋白(Sigma公司）；氯金酸(上海精細化工研究所）；無水碳酸鉀(國藥集團化學試劑有限公司）；檸檬酸三鈉(上海青析化工有限公司）；氯化鈉(上海文旻生化科技有限公司）；蔗糖(AMRESCO公司）；雙蒸水(自來水由純水儀制得）；硝酸纖維素膜(NC膜）(美國Millipore公司）；玻璃纖維膜8964(Ahlstorm公司）；PVC塑料底板、吸水紙(上海金標生物科技有限公司）.

2 試紙條的制備

2.1 納米金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法［10-11］制備20 nm納米金.向經酸洗凈并干燥過的錐形瓶中加入99 mL雙蒸水，再加入1%氯金酸溶液1 mL.將錐形瓶置于數顯恒溫磁力攪拌器上加熱至沸騰，沸騰后在劇烈的攪拌下一次性迅速準確地加入新鮮配制的1%檸檬酸三鈉溶液2 mL，當溶液完全變為透明的酒紅色時，繼續煮沸15 min，即制得所需的納米金，常溫下繼續攪拌冷卻至室溫，4℃儲存待用.

2.2 納米金標記抗體條件選擇及標記

2.2.1 最適pH值的確定

分別取1 mL納米金溶液用0.1 mol／L碳酸鉀溶液調節pH值至6.0、7.0、8.0、9.0、10.0.各取不同pH的納米金溶液200μL至5支EP管中，再加入4μg鼠抗RBP單克隆抗體(S-113-7），混合均勻，室溫反應10 min后，向其中加入40μL 10%氯化鈉溶液，靜置2 h，觀察各管顏色變化.

2.2.2 最適蛋白量的確定

向8支EP管中分別加入200μL納米金溶液，用0.1 mol／L碳酸鉀溶液調至最適pH值.再分別加入0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg鼠抗RBP單克隆抗體(S-113-7），反應20 min后，各管加入10%氯化鈉溶液40μL，靜置2 h，觀察各管顏色變化.

2.2.3 納米金的標記

取納米金溶液1mL，用0.1mol／L碳酸鉀溶液調至最適pH值，加入適量的鼠抗RBP單克隆抗體(S -113-7），混合均勻，反應20 min后，加入10%BSA溶液20μL，混合均勻，反應20 min.在13000 r／min、4℃條件下離心15 min，棄去上清液.沉淀物用硼酸鹽緩沖溶液(含5%BSA）重懸至原體積.再次以同樣的條件離心后棄去上清液，濃縮至原體積的1／ 20，即得納米金-RBP復合物，4℃保存.

2.3 硝酸纖維素膜的制備

將NC膜貼在具有粘性的PVC底板中間，用單維往復劃膜儀在NC膜的不同位置噴點鼠抗RBP單克隆抗體(S-64-11）及羊抗鼠二抗，自上至下依次為質控線(C線）、檢測線(T線），37℃烘干2 h備用.

2.4 結合墊的制備

選用玻璃纖維素膜作為結合墊材料，將上述制備的納米金-RBP復合物用硼酸緩沖溶液(含0.1 gPVP，0.1 gPEG，2.5 g蔗糖等）稀釋至原體積的4／ 5，并噴于結合墊上，37℃烘干2 h備用.

2.5 樣品墊的制備

選用玻璃纖維素膜作為樣品墊材料，將其放入樣品墊處理液(含BSA，吐溫等的0.01 mol／L pH＝7.4 PBS）中浸泡后，37℃真空干燥2 h備用.

圖1 試紙條的組裝效果圖

2.6 試紙條的組裝

將結合墊、樣品墊、吸水紙依次按由下到上的順序粘貼在PVC底板上.用ZQ微電腦自動斬切機切割成4 mm寬的試紙條.將切好的試紙條裝在檢測卡(如圖1）里面與干燥劑封裝在鋁箔袋內37℃保存待用.

2.7 試紙條的結果判定（如圖2）

當樣品滴加至加樣孔反應15 min后，若C線、T線均為紅色且T線呈深紅，則判定為強陽性；若C線、T線均為紅色且T線呈淺紅，則判定為弱陽性；若只有C先呈紅色，則判定為陰性；若C線無色，則判定為試紙條無效.

圖2 納米金免疫層析法檢測判定圖

3 結果與分析

3.1 納米金的表征

3.1.1 納米金的紫外-可見吸收光譜

用全波長酶標儀在400～600 nm波段內對制備的納米金進行掃描.從圖3中可以看出，20 nm的納米金在520 nm處有一最大吸收值，這與文獻報道的相一致［12］，表明此粒徑的納米金適合標記抗體.

圖3 納米金紫外—可見吸收曲線

3.1.2 納米金的粒徑及Zeta電位分析

新制備的納米金平均Zeta電位是-41.9mV(圖4），表明此電位的納米金可較好地同RBP結合.納米金顆粒的平均直徑大約為20.57 nm，其中分布完全是24.06 nm，分布寬度為9.260 nm，多分散性PDI＝0.148(圖5），表明制備的納米金符合免疫試驗的要求.

圖4 納米金的Zeta電位掃描曲線

圖5 納米金的粒徑分布曲線

圖6 納米金的電鏡TEM圖

3.1.3 納米金顆粒的透射電鏡觀察

新制備的納米金用透射顯微鏡(TEM）進行掃描(圖6），從圖6中可以看出納米金顆粒粒徑在20 nm左右，形貌接近于球形，而且粒徑分布比較均一.此納米金顆粒粒徑分析結果與Zetasizer電位分析儀測定結果相一致，可以滿足納米金標記抗體實驗的要求.

3.2 納米金標記條件的確定

3.2.1 最適pH值的確定

RBP單抗在pH為6～10中顏色發生著不同的變化，其中隨著pH逐漸增大，顏色的變化程度逐漸減弱.當pH＜8.0時，管中溶液顏色呈不同程度的灰藍色；當pH≥8.0時，管中溶液顏色基本無變化.因此，可以確定納米金標記的最佳pH值為9.0.

3.2.2 最適RBP抗體量的確定

當200μL納米金溶液中RBP抗體量小于4μg時，溶液不同程度地發生聚沉，顏色變成灰色、紫色；而RBP抗體量大于3μg時，溶液顏色為酒紅色不變，所以200μL體系中最適抗體量為4μg，即20 mg／L(相當于20μg／mL），實際工作中增加20%，故實際用量為24 mg／L(圖7）.圖7中RBP抗體量分別為：0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g／200 L.

圖7 不同抗體量的RBP和納米金結合顯色圖

3.3 試紙條的靈敏度分析

檢測一系列不同濃度的RBP標準品溶液，溶液濃度依次為：0、10、30、60、100、150、200、300、500、1000μg／L.在15 min內觀察各試紙條的顯色情況，當濃度為1000μg／L時，T線為深紅色，C線稍淺.隨著濃度逐漸降低，T線顏色逐漸變淺，C線逐漸變深.當濃度為150μg／L時，T線顏色幾乎消失，C線顏色最深，由此判斷，試紙條的靈敏度可達150μg／L.

3.4 試紙條的重復性試驗

取 300， 1500，5000μg／L 3種濃度的RBP標準品溶液，按照相同的檢測方法對每個濃度平行檢測6次，并用納米金免疫層析定量分析儀掃描讀取T／C值.每個濃度6次檢測的T／C值的標準差與平均值的比值即為變異系數(即為CV值），計算得到3種濃度RBP標準品溶液的CV值分別為9.83%、9.45%、8.89%，該CV值相近，說明所得的試紙條具有良好的重復性.

3.5 試紙條的特異性實驗

將尿微量白蛋白(ALB）、轉鐵蛋白(TRF）、β2-微球蛋白(β2-MG）、尿纖維連接蛋白(FN）、溶菌酶(LZM）用PBS稀釋到60、100、200、300、500μg／L等不同濃度的標準品溶液進行檢測，發現只有C線變紅，T線沒有變化(表1），說明該試紙條的特異性良好.

表1 試紙條特異性實驗

3.6 試紙條的檢測范圍的確定

用0.01 mol／L pH＝7.4 PBS緩沖液將RBP標準品配制成終濃度分別為150、300、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000μg／L的RBP溶液，用試紙條檢測T／C值，每個濃度測定3次，取其平均值.測定結果表明，從6000μg／L開始，T／C值出現下滑(圖8）.因此，確定RBP試紙條的檢測下限為150μg／L，上限為5000μg／L.

圖8 RBP標準品溶液濃度為150～5000μg／L時的試紙條檢測結果圖

3.7 RBP定量測定及標準工作曲線的繪制

在最優化的實驗條件下，以濃度為橫坐標，T／C值為縱坐標作圖，建立納米金定量檢測RBP標準工作曲線.樣品濃度為150～5000μg／L時，每個濃度檢測3次，對納米金免疫層析定量分析儀掃描得到的T／C值取平均值(表2）.RBP濃度與T／C值之間呈良好的對數關系(圖9），對數回歸方程為Y＝0.7072 ln(x）-3. 4867，相關系數R2＝0. 9981，對數關系良好.

表2 RBP定量檢測結果(37℃）

3.8 試紙條的穩定性

通過實驗可以得出，RBP納米金免疫層析定量檢測試紙條在4℃和室溫下保存4個月，37℃下保存20 d，試紙條對RBP的檢測結果沒有發生顯著變化.RBP濃度與免疫金標層析儀讀數T／C值之間仍然呈良好的對數關系(表3、圖10），對數回歸方程為Y＝0.685 ln(x）-3. 4337，相關系數R2＝0. 9966，對數關系良好.

表3 37℃保存20 d后RBP定量檢測結果

圖10 20d后納米金免疫層析試紙條檢測RBP標準品系統擬合工作曲線

該研究結果表明，所得的試紙條在4℃、室溫和37℃下穩定性好.依據阿倫尼烏斯公式：K＝A e(-Ea／RT），其中K為速率常數、R為摩爾氣體常量、T為熱力學溫度、Ea為表觀活化能(約等于19.5 Kcal／mol）、A為指前因子.可以推算，37℃條件下放置20 d相當于正常條件下有效期為2年.

4 結 論

(1）利用納米金免疫層析技術實現了對RBP的快速定量檢測.采用雙抗夾心法，以1對RBP單抗分別用作免疫金抗體檢測線處抗體，以羊抗鼠作質控線.通過利用儀器讀取納米金的顏色強弱的信號以實現定量檢測.此法克服了傳統方法的諸多不足，為臨床對RBP的腎小管損傷大規模篩查、診斷以及術后監測提供了一種全新的有效定量檢測方法.

(2）利用Frens法制備的20 nm的納米金形貌均一、分散性好，符合免疫層析反應的各項要求.通過對樣品墊處理液、硼酸緩沖溶液、抗體濃度等不斷優化，較好地規避了可能出現的假陽性、假陰性，并在此基礎之上建立了具有較寬的檢測范圍和較低的檢測限的快速定量檢測體系.

(3）建立的快速定量檢測RBP體系與尿微量白蛋白(ALB）、轉鐵蛋白(TRF）、β2-微球蛋白(β2-MG）、尿纖維連接蛋白(FN）、溶菌酶(LZM）沒有交叉反應，重復性以及穩定性良好.在4℃和室溫下可以保存4個月，具有廣泛的醫學、研究實用價值.

(4）通過研制的試紙條對RBP標準品的定量檢測結果分析，表明該試紙條的最低檢測限可達150μg／L.同時在150～5000μg／L范圍內具有良好的對數關系，相關系數R為0.99.此法在快速(15 min顯示結果）檢測的基礎上實現了有效的定量，將深刻改變目前臨床對RBP的檢測方式.

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Gold nanoparticle immunochromatographic assay for quantitative detection of urinary RBP

XU Kuan，SHEN Hebai，ZHU Longzhang*
(College of Life and Environment Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

A rapid quantitative detection of urinary RBP was established by using nano-gold immunochromatography(sandwich method）and trisodium citrate reductionmethod and a rapid immunochromatographic test strip was developed.Theimmunochromatographic test strip can quantitatively detect RBPwithin 15minutes.The detection limitwas150ng／mL and detection rangewas from 150 to 5000 ng／mL.There were no cross-reactions with others kidney diseasemarkers，such as urinary albumin(ALB），transferrin protein(TRF），β2-microglobulin(β2-MG），urinary fiber connecting protein(FN），and lysozyme(LZM）.The results indicate that it is a quick and simplemethod with strong specificity，high sensitivity，and wide detection range.The rapid detection method will have extensive clinical applications in the early diagnosis of proximal tubular damage，kidney disease，diabetic nephropathy，and processmonitoring.

Urinary RBP；nano-gold；immunochromatographic assay；quantitative detection

O 648

A

1000-5137(2013）02-0154-07

（責任編輯：郁 慧）

2012-12-21

上海市教委基金(11nm0505300）

徐 寬(1986-），男，上海師范大學生命與環境科學學院碩士研究生；朱龍章(1956-），男，上海師范大學生命與環境科學學院教授.

*通信作者