HIF-1α和STAT3在胃癌中的表達及臨床意義

杜子春 馬利 熊兵紅 程勇 張才全

胃癌是我國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一。胃癌的病因尚未闡明，目前認(rèn)為致癌過程是多階段的，包括多個連續(xù)的“獨立”事件，即基因積累性改變的結(jié)果。多數(shù)腫瘤的生長具有缺氧的微環(huán)境，腫瘤形成的關(guān)鍵步驟就是對缺氧的適應(yīng)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α)是細(xì)胞適應(yīng)缺氧而產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，在多種惡性腫瘤組織中，HIF-1α均有過度表達并參與腫瘤血管形成［1，2］，包括腦、肺、膀胱、乳腺、結(jié)腸、卵巢、胰腺、腎和前列腺。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)為STAT轉(zhuǎn)錄因子家族成員中的重要一員。被認(rèn)為是一種癌基因，它與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密不可分，其持續(xù)激活導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化［3-6］，本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測胃癌組織中HIF-1α和STAT3的表達，并研究兩者在胃癌發(fā)生中的相互作用，期望為胃癌的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院及外院2010年10月至2011年10月胃腺癌石蠟包埋標(biāo)本60(男46，女14)例，年齡26～74(平均55.6)歲。其中高分化17例，中分化27例，低分化16例，浸潤程度:黏膜層14例，肌層20例，達漿膜層26例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，未轉(zhuǎn)移的32例，另取該組胃腺癌病例中腫瘤手術(shù)切除標(biāo)本切緣處正常胃黏膜(病理證實)石蠟包埋標(biāo)本15例及癌旁黏膜15例作為對照。胃癌的TNM分期按照AJCC 2003年版胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)進行。

1.2 方法

1.2.1 染色方法 免疫組織化學(xué)染色:采用免疫組織化學(xué)SP法，已知陽性切片做陽性對照，以PBS代替一抗作空白對照，一抗選用兔抗人HIF-1α多克隆抗體(1∶150)(稀釋度為1∶100)和STAT3兔抗人多克隆抗體(1∶100)。用SP法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒操作，操作步驟根據(jù)試劑盒說明進行，每組試驗均以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 結(jié)果判斷 HIF-1α，STAT 3陽性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色，采用二級計分法，即以染色強度與陽性細(xì)胞的百分比的乘積做為半定量標(biāo)準(zhǔn):染色強度:0分為無色;1分為黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色(深淺與背景色相對比)。陽性細(xì)胞所占的百分比:陽性細(xì)胞≤10%為1分;10% ～50%為2分;51% ～75%為3分;＞75%為4分。染色強度與陽性細(xì)胞所占的百分比的乘積0～3分為陰性(-);＞3分為免疫反應(yīng)陽性(+)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0版本統(tǒng)計學(xué)軟件對結(jié)果進行分析。根據(jù)資料性質(zhì)使用χ2檢驗、Spearman檢驗、Wilcoxon秩和檢驗和Kruskal-Wallis法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α和STAT 3在胃癌中的表達 HIF-1α和STAT 3染色的陽性細(xì)胞在組織中呈彌漫和(或)散在分布，HIF-1α著色部位主要在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)。STAT 3定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(見圖1、圖2)。15例正常組織中HIF-1α和STAT 3均無表達;HIF-1α和STAT 3在15例癌旁組織中陽性表達率分別為20%(3/15)和26.67%(4/15);在60例胃癌組織中的陽性表達率分別為75%(45/60)和70%(42/60)。兩者在正常、癌旁、癌組織中的表達呈升高趨勢，且癌組織與癌旁組織比較，癌組織與正常組織比較，其差異性均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 HIF-1α和STAT 3表達陽性與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 HIF-1α和STAT 3的陽性表達率與年齡、性別、腫瘤的分化程度均無明顯關(guān)系(均P＞0.05)。HIF-1α和STAT 3的表達均與胃癌的浸潤深度、臨床分期以及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在相關(guān)性(均P＜0.05，見表1)。

表1 胃癌臨床病理參數(shù)與HIF-1α和STAT 3陽性表達間的關(guān)系(例，%)

圖1 HIF-1α在胃癌中的胞質(zhì)呈陽性反應(yīng)(S-P法×200)

圖2 STAT3在胃癌中的胞質(zhì)胞核呈陽性反應(yīng)(S-P法×200)

2.3 HIF-1α與STAT3蛋白表達的關(guān)系 60例胃癌中HIF-1α和STAT3蛋白共同表達陽性者43例，共陰性者5例，HIF-1α表達陽性而STAT3表達陰性者7例，HIF-1α表達陰性而STAT3表達陽性者10例。二者表達呈正相關(guān)(Spearman等級相關(guān)系數(shù)r=0.317，P＜0.05)。見表2。

表2 胃癌組織中的STAT3和HIF-1α與表達的相關(guān)性(例)

3 討論

胃癌是一個多基因多階段的復(fù)雜病變過程。大量的證據(jù)證實致癌基因和抑癌基因的一系列遺傳學(xué)改變參入到其中，如致癌基因Ras的激活，以及抑癌基因APC、P53等的失活都已被證實參入了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。所以探討STAT3和HIF-1α在胃癌生物學(xué)行為中的病理價值，尋找胃癌生物治療的新途徑和預(yù)防治療胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的新方法，成為提高胃癌患者生存率的關(guān)鍵和研究熱點。

HIF-1缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體細(xì)胞中，由HIF-1α和H IF-1β構(gòu)成異二聚體，其中HIF-1α是主要的氧調(diào)節(jié)亞基。HIF-1α具有廣泛的靶基因譜，可啟動多種基因的轉(zhuǎn)錄，在正常組織及良性病變中無表達，其功能涉及到腫瘤血管生成，細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控、糖代謝、離子代謝、浸潤轉(zhuǎn)移、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞凋亡和增殖、細(xì)胞黏附及炎性反應(yīng)等多個方面。HIF-1α在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，它不僅調(diào)節(jié)血管形成，調(diào)節(jié)眾多的下游基因以維持或促進腫瘤的發(fā)展，而且它可以反饋接受腫瘤生長過程中所產(chǎn)生的因子或缺氧環(huán)境上調(diào)表達，如此形成惡性循環(huán)，促進腫瘤生長，調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)特性。胃癌組織中HIF-1α表達增高可以作為胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移的重要判定指標(biāo)，可能為胃癌的早期診斷及臨床判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。本結(jié)果顯示，HIF-1α癌組織中的表達明顯高于癌旁和正常組織，其表達與腫瘤的浸潤深度、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間有相關(guān)性，這也說明HIF-1α高表達的腫瘤組織具有較強的浸潤轉(zhuǎn)移能力。

STAT3是一關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活蛋白，研究已證實STAT3的持續(xù)激活、表達水平升高與許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后相關(guān)［7，8］，STAT3的表達可以調(diào)控該轉(zhuǎn)錄因子參與的多種異常的腫瘤信號途徑:如抗凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2的表達，細(xì)胞周期控制基因C-fos、C-Myc、cyclin D1的表達等，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、阻斷細(xì)胞凋亡［7，8］。因此STAT3基因被公認(rèn)為是重要的癌基因之一。研究發(fā)現(xiàn)STAT3與胃癌的發(fā)病關(guān)系密切，Gong等［4］發(fā)現(xiàn)胃癌組織中STAT3的表達與VEGF、MVD(微血管密度)有關(guān)，可能通過活化VEGF的表達增加了胃癌的血管表現(xiàn)型，促進了胃癌的發(fā)展與進展。Kanda等［9］發(fā)現(xiàn)STAT3組成性活化于多種胃癌細(xì)胞系中，利用異位顯性負(fù)相STAT3及酪氨酸磷酸化抑制劑AG490抑抑制STAT3的表達可以誘導(dǎo)凋亡。多項研究已證實，STAT3在胃癌組織中過度表達。我們的結(jié)果也表明了胃癌組織中存在著STAT3的高表達，并且與胃癌的TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分級密切相關(guān)，與以往研究結(jié)果一致。因此STAT3的異常活化與胃癌的惡性生物學(xué)行為以及胃癌的發(fā)病機制有著極其密切的關(guān)系。

在多種癌癥中STAT3活性表達和HIF-1都在上游被調(diào)控。有研究證明，需要Stat3才能誘導(dǎo)基礎(chǔ)和生長信號導(dǎo)致的HIF-1表達。此外，由多個腫瘤生長刺激因(IL-6R，C-Src，Her2/Neu)誘導(dǎo)的 VEGF在沒有 STAT3信號時會減少［10］。Xu等［11］進一步闡明了STAT3能夠調(diào)節(jié)Akt的表達，進而上調(diào)生長因子誘導(dǎo)的HIF-1的高表達，他們在體外實驗中，以小分子抑制劑作用于STAT3實現(xiàn)了阻斷HIF-1和VEGF表達，在動物體內(nèi)實驗中顯示，當(dāng)STAT3被抑制后，由IL-6R和Jak/Stat，PI3K/Akt等信號通路誘導(dǎo)激活的血管生成能力也被抑制，從而抑制了腫瘤生長和血管生成。因此，STAT3可能對HIF-1和VEGF的表達起著重要的調(diào)控作用，對于腫瘤的靶向治療具有更大意義。我們研究顯示STAT3與HIF-1α在胃癌組織中的表達呈正相關(guān)，表明STAT3可能調(diào)節(jié)胃癌組織中HIF-1α、VEGF的表達，參與其侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，STAT3與HIF-1α在胃癌組織中過度表達，共同提示著它們與胃癌的關(guān)系非常密切。STAT3與HIF-1α表達呈正相關(guān)，提示兩者可能在胃癌的發(fā)生及發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移中起著重要協(xié)同作用，臨床上檢測二者的表達有助于胃癌治療及判斷預(yù)后，但是其具體分子生物學(xué)作用機制需要進一步研究闡明。

［1］Miyachi K，Sasaki K，Onodera S，et al.Correlation between surviving mRNA expression and lymph node metastasis in gastric cancer.Gastric Cancer，2003，6(4):217-224.

［2］劉興振，沈康平.缺氧誘導(dǎo)因子1功能調(diào)節(jié)及其在凋亡中的研究進展.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39(19):2675-2677.

［3］Yang SF，Wang SN，Wu CF，et al.Altered p-STAT3(tyr705)expression is associated with histological grading and intratumour microvessel density in hepatocellular carcinoma.Journal of Clinical Pathology，2007，60(6):642.

［4］Gong WD，Wang LW，Yao J C，et al.Expression of activated signal transducer transcription 3 predicts expression endothelial growth factor in and phenotype of human gastric cancer.Clin Cancer Res，2005，11(4):1386-1393.

［5］Achcar Rde O，Cagle P T，J agirdar J.Expression of activated and latent signal transducer and activator of transcription 3 in 303 nonsmall cell lung carcinomas and 44 malignant mesotheliomas:possible role for chemotherapeutic intervention.Archives of Pathology＆Laboratory Medicine，2007，131(9):1350.

［6］Jing N，Tweardy D J.Targeting St at3 in cancer therapy.Anticancer Drugs，2005，16(6):601.

［7］Weerasinghe P，Garcia G E，Zhu Q，et al.Inhibition of Stat3 activation and tumor growth supp ression of non-small cell lung cancer by G-quartet oligonucleotides.International Journal of Oncology，2007，31(1):129.

［8］Aggarwal B B，Sethi G，Ahn K S，et al.Targeting signal transducer and activator of transcription-3 for prevention and therapy of cancer:modern target but ancient solution.Annals of the New York A-cademy of Sciences，2006，1091:151.

［9］Kanda N，Seno H，Konda Y，et al.STAT3 is constitutively activated and supports cell survival in association with survivin expression in gastric cancer cells［5］.Oncogene，2004，23，4921-4929.

［10］Gray MJ，Zhang J，EllisL M，Semenza GL，Evans DB，Watowich SS，et al.HIF-1alpha，STAT3，CBP/p300 and Re-f1/APE are components of a transcriptional complex that regulates Src-dependent hypoxia-induced expression of VEGF in pancreatic and prostate carcinomas.Oncogene，2005，24(19):3110-3120.

［11］Xu Q，Briggs J，Park S，Niu G，Kortylewski M，Zhang S，et al.Targeting Stat3 blocks both HIF-1 and VEGF expression induced by multiple oncogenic growth signaling pathways.Oncogene，2005，24(36):5552-5560.