支氣管肺泡灌洗液TB-DNA測定與其它TB檢測方法比較研究

劉立賓 葉華麗 胡建成 何月龍 范大鵬

浙江省中西醫結合醫院結核實驗室 杭州 310003

·實驗研究·

支氣管肺泡灌洗液TB-DNA測定與其它TB檢測方法比較研究

劉立賓 葉華麗 胡建成 何月龍 范大鵬

浙江省中西醫結合醫院結核實驗室 杭州 310003

目的：探討支氣管灌洗液涂片染色、支氣管灌洗液培養及痰培養三種方法中結核桿菌陽性率與支氣管灌洗液結核桿菌DNA拷貝數的關系。方法：對199例確診肺結核患者分別應用熒光定量聚合酶鏈反應（FQ-PCR）技術檢測支氣管灌洗液（BALF）結核分枝桿菌DNA（TB-DNA），并按TB-DNA拷貝數分為A（1×103～）、B（1×105～）、C（≥1×107）三組，并對所有患者行灌洗液涂片染色、灌洗液培養及痰培養結核桿菌。結果：灌洗液涂片染色法A、B、C三組陽性率分別為12.0%、60.2%、92.7%，三組間陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05），三組間兩兩比較差異有統計學意義（P均＜0.05），且陽性率C組＞B組＞A組；灌洗液培養法A、B、C三組陽性率分別為18.7%、56.6%、87.8%，三組間差異有統計學意義（P＜0.05），兩兩比較差異有統計學意義（P均＜0.05），陽性率C組＞B組＞A組；痰培養法A、B、C三組陽性率分別為26.7%、65.1%、82.9%，三組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），兩兩比較差異有統計學意義，A組與B組、A組與C組比較P均＜0.05，B組與C組比較P＜0.05。結論：支氣管灌洗液涂片染色、灌洗液培養、痰培養結核桿菌陽性率均隨支氣管灌洗液中結核桿菌DNA拷貝數遞增而增高。。

支氣管肺泡灌洗液 結核桿菌 熒光定量PCR

肺結核為全球流行性感染性疾病之一[1]，結核病的病原學檢查是確定結核病診斷和化療方案的重要依據一[2]。涂片法簡單、快速、經濟，但靈敏性差，檢出率低。結核桿菌培養仍是目前診斷肺結核的金標準，尤其是進一步可行菌型鑒定和藥敏實驗，并可鑒定死菌與活菌，被譽為結核病診斷的黃金標準，結核桿菌培養法雖特異性高，但所需時間較長[3]。熒光定量PCR（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）是近年用于臨床病原菌檢測的一種具有高靈敏性、高準確性、高特異性且定量范圍寬、操作簡便、快速安全、污染最少的可靠的DNA體外擴增技術[4]。FQ-PCR法檢測支氣管肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）中結核桿菌DNA（tuberculosis-DNA，TB-DNA）已成為快速診斷結核桿菌感染的一種非常有前途的方法，并被廣泛應用到臨床[5]。我們應用FQ-PCR法檢測BALF中TB-DNA，并與涂片法、培養法陽性率進行比較，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2011年5月—2011年12月本院住院確診肺結核患者199例，年齡18～80歲，男102例，女97例。所有患者行電子支氣管鏡下集取支氣管肺泡灌洗液，并用FQ-PCR法檢測BALF中TB-DNA，BALF涂片找抗酸桿菌，BALF培養及痰培養。同時將研究對象按FQ-PCR檢測TB-DNA拷貝數分成A組（1×103～）75例、B組（1×105～）83例、C組（≥1×107）41例。

1.2 處理方法

1.2.1 灌洗液涂片染色法 纖支鏡檢查時于鏡下見異常者或于X線胸片∕CT異常的相應葉段內行支氣管肺泡灌洗，收集BALF 5mL，常規處理后，在生物安全柜中涂片，待干后經抗酸染色，以連續觀察不少于300個不同視野未發現抗酸桿菌為陰性，其余為陽性。

1.2.2 結核桿菌培養法 所有患者標本按《結核病診斷細菌學檢查規程》進行結核菌培養。從改良羅氏培養基上取單個菌落，參照《結核病診斷細菌學檢查規程》的方法進行結核桿菌鑒定。

1.2.3 FQ-PCR法 收集BALF 5mL，行FQ-PCR檢測。標本中加入2倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫下放置30min液化，液化過程中振蕩2～3次，取1mL標本加入離心管中，12 000rpm離心5min，棄上清液留沉淀，加無菌生理鹽水1mL洗滌，10 000rpm離心5min，再重復洗滌1次，標本加DNA提取液，于100℃15min裂解，15 000rpm離心10min。配制好PCR混合液（引物，熒光探針，MgCl2，Taq酶），將DNA模板加入PCR混合液，設陽性對照（1×104，1×106，1× 108），陰性對照。放入PCR擴增儀，設定程序，擴增。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件包分析數據，應用卡方檢驗。

2 結 果

2.1 灌洗液涂片陽性率 FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中，A、B、C三組灌洗液涂片陽性率分別為12.0%、60.2%、92.7%，三組間陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05）。三組間兩兩比較P均＜0.05，且陽性率C組＞B組＞A組。灌洗液涂片陽性率隨支氣管灌洗液FQ-PCR拷貝數的遞增而增高，見表1。

表1 各PCR組灌洗液涂片陽性率比較 例

2.2 灌洗液培養陽性率 FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中，A、B、C三組灌洗液培養陽性率分別為18.7%、56.6%、87.8%，三組間陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05）。三組間兩兩比較，P均＜0.05，且陽性率C組＞B組＞A組。灌洗液培養陽性率隨支氣管灌洗液FQ-PCR拷貝數的遞增而增高，見表2。

表2 各PCR組灌洗液培養陽性率比較 例

2.3 痰培養陽性率 FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中，A、B、C三組痰培養陽性率分別為26.7%、65.1%、82.9%，三組間陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05）。三組間兩兩比較，A組與B組、A組與C組P均＜0.05，B組與C組P＜0.05。痰培養陽性率隨支氣管灌洗液FQ-PCR拷貝數的遞增而增高，見表3。

表3 各PCR組痰培養陽性率比較

3 討論

FQ-PCR系統是一密閉的DNA擴增檢測系統，在將擴增體系所需各物質加樣完畢后，即可進行擴增和檢測，擴增產物的檢測是通過系統對熒光探針5c端游離的R基團熒光強弱的分析來判斷擴增產物的量，當PCR反應體系中有目的基因存在，就會擴增出特異核酸片段，熒光探針即會根據堿基配對的原理與之雜交。PCR反應每復制1個特異核苷酸片段，就有1個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數目和PCR產物是一對一的關系，因此用熒光檢測技術檢測出的熒光信號有無或強弱，即代表擴增產物有無或多少[6]。由于肺泡灌洗液進入遠端氣道及肺泡腔中接觸病灶范圍廣，收集量大，含菌量多，標本充分離心沉淀。同時，灌洗刺激患者咳嗽，更有利于局部支氣管分泌物的引流[7]。故本研究選取支氣管灌洗液檢測結核分枝桿菌DNA。

已有資料[8]表明，定量PCR與病原菌數量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關性。本研究顯示，FQ-PCR檢測BALF中，C組（≥1×107）灌洗液涂片染色、灌洗液培養、痰培養結核桿菌陽性率明顯高于A組（1×103～）和B組（1× 105～）。因此我們認為，臨床上分析FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液TB-DNA拷貝數可以評估其它三種方法的陽性率。FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中拷貝數明顯增高時，涂片染色、灌洗液培養、痰培養的陽性率明顯增高，我們推測，此時檢測到的結核桿菌可能為活菌，細菌正處于繁殖期，或者患者可能正處于一個感染活動期。結核桿菌培養是實驗室檢測結核桿菌的“金標準”，FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中拷貝數越高，結核桿菌培養陽性率也就越高，熒光定量PCR法隨著拷貝數的增高而無限接近這個“金標準”。反之，FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中拷貝數值偏低時，涂片染色、灌洗液培養、痰培養的陽性率相應地明顯降低，此時檢測到的細菌多為死菌，或結核桿菌正處于靜止期、休眠期[9]，而患者正處于潛伏感染期、輕度感染期。

綜上所述，對FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液TB-DNA拷貝數的分析可反映病原菌數量與感染性疾病病情的輕重程度，反映結核桿菌的繁殖情況，對鑒定死菌活菌也有一定的意義。FQ-PCR法檢測BALF中TB-DNA拷貝數，對抗結核藥物的使用的指導意義尚需進一步探討。

［1］Vishnevskiiu BI，Manicheva 0A，Vishnevskaia EB，et al.The specific features of bacterial isolation and dmg resistance of Mycobacteria in extraptd monary tuberculosis［J］.Probl Tuberk Bolezn Legk（俄文），2006，11（1）：18-21．

［2］Kubista M，Andrade JM，Bengtsson M，et al.The real-time polymerase chain reaction［J］.Mol Aspects Med，2006，27（2-3）：95-125．

［3］Poole K.Efflux-mediated antimicrobial resistance［J］.J Antimicmb Chemother，2005，56（1）：20-51．

［4］李海東，劉國祥.熒光定量PCR測定支氣管肺泡灌洗液中Tb-DNA診斷肺結核的臨床價值［J］.西南軍醫，2005，7（6）:10-11.

［5］Cafforio P，Dammacco F，Gernone A，et al.Statins activate the mitochondrial pathway of apoptosis in human lymphoblasts and myelom cells［J］.Carcinogenesis，2005，26（5）：883-891．

［6］彭德虎，林云，石琳.熒光定量聚合酶鏈反應技術檢測結節病肺泡灌洗液結核分枝桿菌DNA［J］.臨床肺科雜志，2006，11（4）:541.

［7］支氣管肺泡灌洗液的結核分枝桿菌快速培養對疑似肺結核的診斷價值［J］.中國臨床醫學，2010，17（1）:35-36

［8］邵俊斌，王占坤，陳智，等.實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測痰結核桿菌DNA及其臨床應用［J］.中華結核和呼吸雜志，2003，26（8）:490.

［9］張紅漫，李志惠，趙杰，等.熒光定量PCR測定支氣管肺泡灌洗液中T bDNA對涂陰肺結核的診斷價值［J］.中國防癆雜志，2009，31（4）：227-229.

Relationship Between fluorescent quantitative-PCR Detecting Bronchoalveolar Lavage Fluid Tuberculosis DNA and other Tuberculosis detecting methods

LIU Libin, YE Huali, HU Jiancheng, et al. Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou (310003), China

Objective：To investigate the relationship between the copy number of tuberculosis-DNA(TB-DNA）in bronchoalveolar lavage fluid(BALF）by fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR)and the positive rates of BALF smearing,BALF training,and sputum training.Methods:TB-DNA in BALF from 199 definite tuberculosis patients was determined by FQ-PCR and then all samples were random ly divided into group A(1×103～）,group B（1×105～）,and group C（≥1×107）.All samples were treated with TB BALF smearing,TB BALF training,and TB sputum training.Results:In TB BALF smearing,the positive rate was significantly different in group A,B and C (12.0%,60.2%and 92.7%,respectively,P＜0.05）,with the highest in group C and the lowest in group A.The positive rate was significantly different in group A,B and C in TB BALF training(18.7%,56.6%and 87.8%,respectively,P＜0.05)and among them the difference was significant,with the highest in group C and the lowest in group A.The same result was found in TB spurum training(positive rates of group A,B and C were 26.7%, 65.1%and 82.9%,respectively).Conclusion:The positive rates of BALF smearing,BALF training,and sputum training increased with the rise of TB-DNA copy number in BALF.

tuberculosis bronchoalveolar lavage fluid fluorescent quantitative PCR

2012-09-26