TNF-α和IL-1β對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體mRNA表達(dá)的影響

郭小芳 劉海波 任惠龍 龔維坤

浙江省寧波市鄞州人民醫(yī)院 寧波 315040

成興波 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院

TNF-α和IL-1β對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體mRNA表達(dá)的影響

郭小芳 劉海波 任惠龍 龔維坤

浙江省寧波市鄞州人民醫(yī)院 寧波 315040

成興波 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院

目的：觀察腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-1β）對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304）蛋白C受體（EPCR）mRNA表達(dá)的影響。方法：通過體外培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，分別以含TNF-α和IL-1β的培養(yǎng)基孵育ECV304細(xì)胞，行劑量和時間依賴性實驗。采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time PCR）技術(shù)測定ECV304細(xì)胞EPCR mRNA的表達(dá)。結(jié)果：TNF-α和IL-1β均能顯著下調(diào)ECV304 EPCR mRNA的表達(dá)，并呈劑量和時間依賴性（P＜0.05）。結(jié)論：TNF-α和IL-1β可能通過顯著下調(diào)ECV304上EPCR mRNA的表達(dá)而成為損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能的一個新作用機制。

內(nèi)皮細(xì)胞 腫瘤壞死因子 白細(xì)胞介素-1 內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體

內(nèi)皮細(xì)胞功能受損是動脈粥樣硬化的始動因素，也是心腦血管疾病發(fā)生的重要原因[1]。既往研究[2]顯示，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）作為炎癥細(xì)胞因子，在內(nèi)皮細(xì)胞功能受損及動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要的作用，但其作用機制尚不十分清楚。內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（endothelial protein C receptor，EPCR）是近年發(fā)現(xiàn)的蛋白C（protein C，PC）系統(tǒng)的一個新成員，主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，它能與PC特異性結(jié)合，使PC活化效率提高5倍，而發(fā)揮抗凝作用，近年的研究表明EPCR也有重要的抗炎作用[3-5]。而炎癥因子是否通過影響EPCR而損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，目前還不十分明確。本研究觀察炎癥因子TNF-α、IL-1β對EPCRmRNA表達(dá)的影響，探討炎癥因子損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能的新機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；小牛血清、胎牛血清購自杭州四季青公司；瓊脂糖購自美國Amresco公司；胰酶購自Difcd公司；FITC-羊抗鼠二抗購自Immunotech公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；DEPC購自BBI公司；M-MLV、隨機引物和dNTP購自美國Promega公司；RNA酶抑制劑（Rnasin）購自上海華美生物技術(shù)公司；Taq酶、人重組腫瘤壞死因子（TNF-α）、人重組白介素-1β（IL-1β）購自上海晶美生物工程有限公司；ECV304為蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血栓與止血研究室凍存細(xì)胞株；鼠抗人EPCR多克隆抗體由王迎春教授惠贈；鼠抗人單克隆β-actin購自Sigma公司。

1.2 主要儀器 Ex TaqTM R-PCR Version 2.1購自大連寶生物公司；Eva Green購自美國Biotium公司；實時定量（real-time）PCR儀MJ Research Option2TM購自MJ公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 方 法

1.3.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞用含15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基按常規(guī)實驗方法培養(yǎng)。實驗用為其3～5代。

1.3.2 實驗方法 實驗一：ECV304細(xì)胞用含TNF-α的低血清（含3%小牛血清）RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，觀察不同濃度TNF-α（2、10、25ng∕mL）時EPCR mRNA的表達(dá)；同時以含TNF-α10ng∕mL的低血清（含3%小牛血清）RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，行時間依賴（1、3、6、12h）實驗。以相同時間的不加刺激劑組為對照。實驗二：ECV304細(xì)胞用含IL-1β的低血清（含3%小牛血清）RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，觀察不同濃度IL-1β（5、10、20ng∕mL）時EPCRmRNA的表達(dá)；同時以含IL-1β10ng∕mL的低血清（含3%小牛血清）RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，行時間依賴（0.5、3、6、12h）實驗。每個實驗組設(shè)5個復(fù)孔，每次實驗重復(fù)3次。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)檢測EPCRmRNA的表達(dá)。

1.3.3 總RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄 利用Trizol試劑從各組ECV304細(xì)胞中提取總RNA，并將mRNA濃度調(diào)整至0.5g∕L。常規(guī)方法逆轉(zhuǎn)錄。

1.3.4 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction， PCR） β-actin引物序列：上游 5′-CTCGCGC?TACTCTCTCTTTC-3′，下游5′-CAGTCTCGATCCCACTTAA-3′，擴增片段330bp。EPCR引物序列：上游：5′-ATTGCTGCCGATACTGCT-3′，下游：5′-AGAGGAAAGGCCAAGGTC-3′，擴增片段318bp。以上序列由上海生物工程有限公司合成。以β-actin（330bp）作內(nèi)參照。反應(yīng)條件：EPCR為94℃4min后開始循環(huán)，94℃40s→58℃40s→72℃40s，共30個循環(huán)，最后72℃10min充分延伸；β-actin為94℃4min后開始循環(huán)，94℃40s→58℃40s→72℃40s，共28個循環(huán)，最后72℃10min充分延伸。反應(yīng)后1.5%瓊脂糖凝膠上樣，電泳鑒定結(jié)果。

1.3.5 實時定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，real-time PCR） 反應(yīng)體系：5× buffer5μL，Mg2+（250Mm）0.25UL，dNTP（10Mm）0.75μL，Taq酶（250U∕50ul）0.25μL，上游引物（10Mm）0.5μL，下游引物（10mM）0.5μL，Evagreen（10mM）0.5μL，雙蒸水15.45μL，cDNA 2μL，共25μL體系；反應(yīng)條件：95℃5min預(yù)變性，95℃15s→58℃25s→72℃25s→78℃0.1s；讀板；50個循環(huán)；60℃～96℃0.3s融解曲線；72℃5min；4℃，forever。結(jié)果計算公式：①相對量＝2－△C（T），△C（T）=目的基因C（T）－內(nèi)參基因C（T）；②實驗組∶對照組的相對量：2－△△C（T），△△C（T）＝實驗組△C（T）－對照組△C（T）。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)方法 各次實驗最終結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）作為統(tǒng)計資料。采用t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR結(jié)果 ECV304細(xì)胞膜上有較高的EPCRmRNA表達(dá)，見圖1。

圖1 ECV304細(xì)胞EPCR mRNA表達(dá)

2.2 TNF-α和IL-1β對ECV304細(xì)胞EPCR mRNA表達(dá)的影響

2.2.1 不同濃度TNF-α對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304）EPCR mRNA的影響 ECV304細(xì)胞EP?CRmRNA水平采用real-time PCR測定。已80%融合的ECV304細(xì)胞中加入TNF-α使其濃度分別達(dá)2、10、25ng∕mL，以低血清（含3%小牛血清）RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)ECV304細(xì)胞為空白對照。12h后EPCR mRNA分別是對照組（100%）的（48.28±0.95）%（P＜0.01）、（35.54±0.87）%（P＜0.01）、（25.42±0.50）%（P＜0.01），TNF-α2ng∕mL時即能明顯下調(diào)ECV304細(xì)胞EPCRmRNA的表達(dá)，EPCRmRNA的表達(dá)呈劑量依賴性，見圖2。

圖2 不同濃度TNF-α對EPCR mRNA的影響

2.2.2 不同時間TNF-α對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304）EPCR mRNA表達(dá)的影響 ECV304細(xì)胞EPCR mRNA水平采用real-time PCR測定。10ng∕mL TNF-α分別作用ECV304細(xì)胞1、3、6、12h。以低血清（含3%小牛血清）RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)ECV304細(xì)胞為空白對照。與空白對照組（100%）相比，1、3、6、12h時EPCRmRNA水平分別是（56.42± 0.58）%（P＜0.01）、（46.38±0.49）%（P＜0.01）、（39.26± 0.61）%（P＜0.05）和（35.54±0.87）%（P＜0.01），TNF-α處理ECV304細(xì)胞1h時即能明顯下調(diào)EPCRmRNA的表達(dá)，EPCRmRNA的表達(dá)呈時間依賴性，見圖3。

圖3 不同時間相同濃度TNF-α對EPCR mRNA表達(dá)的影響

2.2.3 不同濃度IL-1β對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304）EPCR mRNA表達(dá)的影響 ECV304細(xì)胞EPCRmRNA水平采用real-time PCR測定。已80%融合的ECV304細(xì)胞中加入IL-1β使其濃度分別達(dá)5、10、20ng∕mL，以低血清（含 3%小牛血清）RP?MI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)ECV304細(xì)胞為空白對照。12h后EPCR mRNA分別是對照組（100%）的（40.70± 0.98）%（P＜0.01）、（34.44±0.56）%（P＜0.01）、（10.74± 0.36）%（P＜0.01），IL-1β5ng∕mL時即能明顯下調(diào)ECV304細(xì)胞EPCRmRNA的表達(dá)，EPCRmRNA的表達(dá)呈劑量依賴性，見圖4。

圖4 不同濃度IL-1β對EPCR mRNA的影響

2.2.4 不同時間IL-1β對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304）EPCR mRNA表達(dá)的影響 ECV304細(xì)胞EPCR mRNA水平采用real-time PCR測定。10ng∕mL IL-1β分別作用ECV304細(xì)胞0.5、3、6、12h。與空白對照組（100%）相比，0.5、3、6、12h時EPCRmRNA水平分別是（61.68±0.69）%（P＜0.01）、（61.05±0.59）%（P＜0.01）、（50.66±0.29）%（P＜0.05）和（32.94±0.93）%（P＜0.01），IL-1β處理ECV304細(xì)胞0.5h時即能明顯下調(diào)EPCRmRNA的表達(dá)，EPCRmRNA的表達(dá)呈時間依賴性，見圖5。

3 討論

炎癥因子是影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能最重要的因素之一。現(xiàn)已證實TNF-α、IL-1為致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要炎癥因子。它們可以啟動炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，是促使動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素。

EPCR是近年發(fā)現(xiàn)的PC系統(tǒng)的一個新成員，是一個由221個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于大血管內(nèi)皮細(xì)胞，其通過凝血酶（thrombin）-凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）復(fù)合物增進PC活性，提高PC的活化率，從而發(fā)揮抗凝作用[6]。EPCR的抗炎作用是PC系統(tǒng)近年研究的重要進展[7]。在盲腸結(jié)扎穿孔致復(fù)合菌感染的膿毒癥模型中，PC水平明顯下降，同時EPCR表達(dá)代償性增加[8]。

因此，TNF-α、IL-1β有可能是通過影響EPCR從而損傷內(nèi)皮細(xì)胞的功能。目前國外的相關(guān)研究甚少，國內(nèi)目前還未見相關(guān)報道。國外有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α能顯著下調(diào)EPCRmRNA表達(dá)[9-10]，并呈劑量依賴性。另外，Margarita等[11]發(fā)現(xiàn)IL-1β能促進內(nèi)皮細(xì)胞釋放可溶性內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（sEPCR），并下調(diào)ECV304細(xì)胞表面EPCR的表達(dá)。上述研究雖分別表明TNF-α和IL-1β能通過下調(diào)EPCR的表達(dá)而損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，但他們均是對單一炎癥因子的研究，也未同時進行時間及劑量依賴性實驗。而在本研究中同時納入TNF-α和IL-1β這兩種有代表意義的炎癥因子，觀察其對內(nèi)皮細(xì)胞EPCR表達(dá)的影響，并同時進行了時間和劑量依賴試驗，實驗設(shè)計更合理，實驗結(jié)果更具有說服力。本研究發(fā)現(xiàn)EPCR mRNA在ECV304細(xì)胞膜上表達(dá)，TNF-α在2ng∕mL時即能顯著下調(diào)ECV304細(xì)胞EPCRmRNA的表達(dá)，并呈劑量依賴關(guān)系；TNF-α濃度為10ng∕mL時處理ECV304細(xì)胞，1h后即能觀察到EPCRmRNA的表達(dá)較對照組顯著下降，且呈時間依賴關(guān)系，同時也發(fā)現(xiàn)IL-1β具有類似的作用。本研究證明了TNF-α、IL-1β對EPCRmRNA表達(dá)的下調(diào)是其損害內(nèi)皮細(xì)胞功能的新機制，這可能為動脈粥樣硬化的防治提供了新的思路。

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致作者

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Effects of TNF-α and IL-1β on EPCR mRNA in endothelial cells

GUO Xiaofang,LIU Haibo,REN Huilong,et al.Yinzhou People’s Hospital,Ningbo(315040),China

Objective：To investigate the effect of tumor necrosis factor alpha(TNF-α)and interleukin-1 beta (IL-1β)on the expression of endothelial protein C receptor(EPCR)in human umbilical vein endothelial cells (ECV304).Methods:Cultured ECV304 were used as target cells.Different concentrations of TNF-αor IL-1β were added to the culture medium to establish the injury model of ECV304.EPCR mRNA were measured by quantitative real-time PCR.Results:The expression of EPCR in ECV304 was down-regulated by TNF-αand IL-1βin dose and time dependent manner.Conclusion:Both TNF-αand IL-1β may damage the function of endothelial cells by down-regulating the expression of EPCR mRNA.

endothelial cells tumor necrosis factor interleukin-1 endothelial protein C receptor

2012-09-24