青蒿反義鯊烯合酶基因植物表達載體PBI121－SS的構建

羅曉莉 周耀芳

廣州中醫藥大學青蒿研究中心生物技術室，廣東 廣州 510405

青蒿反義鯊烯合酶基因植物表達載體PBI121－SS的構建

羅曉莉 周耀芳

廣州中醫藥大學青蒿研究中心生物技術室，廣東 廣州 510405

目的：利用基因工程對野生青蒿進行人工操縱來提高其青蒿素生產能力。方法：從已有載體pROKII－SS通過PCR獲得鯊烯合酶基因（SS），然后連接pMD－18載體，測序后，酶切，連接表達載體PBI121－SS，通過菌液PCR，抽取質粒，酶切檢測。結果：通過上述方法植物表達載體PBI121－SS構建成功，并轉化農桿菌LBA4404。

青蒿素；反義基因；載體構建

青蒿素（artemisinin）是我國科學家從傳統抗瘧中藥——菊科蒿屬的青蒿（Artemisia annua L.）中分離提純出的含有過氧橋結構的類異戊二烯化合物。其合成的衍生物還有雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚等，它們在瘧疾治療上具有高效、速效和低毒等特點，已成為瘧疾流行地區的“靈丹妙藥”。可是除青蒿外，尚未發現含有青蒿素的其它天然植物資源。青蒿雖然系世界廣布品種，但青蒿素含量隨產地不同差異極大，且含量僅占葉片干重的0.5%左右，最多也不超過1%。本研究擬在克隆青蒿鯊烯合酶基因（SS）的基礎上，利用根癌農桿菌Ti質粒衍生的雙元載體系統構建反義SS基因表達載體，然后利用實驗方法轉化青蒿外植體和再生轉基因植株，通過阻遏青蒿內源SS基因表達以降低類固醇的合成并將碳流引向青蒿素合成的可能性，最終提高青蒿素含量。

1 材料

1.1 菌種和質粒 大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；pMD－18 T載體購自TaKaRa公司；pROKII－SS載體本實驗保存；PBI121載體由本校熱研所提供；根癌農桿菌LBA4404（pAL4404）菌株載體購自TaKaRa公司。

1.2 試劑 質粒DNA純化試劑盒、DNA片段回收試劑盒購自Life Technologies公司；聚合酶鏈反應（PCR）擴增試劑盒及逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）擴增試劑盒、Taq酶、限制性內切酶和T4DNA連接酶購自Takara公司。培養基成分及其他常規化學試劑為國產分析純產品。

1.3 儀器 PCR儀；臺式離心機；凝膠成像分析系統；臺式制冷機；高速冷凍離心機；恒溫振蕩器；微型凝膠電泳儀；紫外分析儀；壓力蒸氣消毒器；電熱恒溫水浴鍋；超凈工作臺；脫色搖床；旋渦混合器。

2 方法

2.1 PCR擴增 以實驗室的pROKII－SS載體為模板，帶有酶切位點的SmaI－SS（5′TCCCCCGGGATGAGTAGTTTGAAAG3′）、BamHI－SS（5′CGCGGATCCTTACAAAGTGAATTC3′）為上下引物，對pROKII－SS進行PCR擴增。擴增條件為：94℃，1分鐘→94℃，30秒，后57℃，1分鐘，然后72℃，1.5分鐘，30個循環→72℃，10分鐘→4℃。反應結束后，取5～10μl PCR產物進行電泳檢測。

2.2 擴增片段回收 長波紫外觀看凝膠，切下含擴增片段的瓊脂糖部分，將凝膠放入eppendorf管中，按試劑盒說明書操作。以回收的純化擴增產物調制下列連接反應：1μl solution I、1μl pMD－18 T載體、5μl PCR產物，3μl H2O、16℃反應過夜。

2.3 大腸桿菌感受態細胞的轉化 加入3～5μl連接產物至感受態細胞，混勻，冰浴30分鐘；42℃熱激90秒，迅速冷卻1～2分鐘，加入1m l LB培養基，37℃振蕩培養1.5h；取200μl菌液涂于含100mg／L Amp的篩選平板上，吹干，37℃倒置培養12～16小時。

2.4 重組質粒鑒定 挑取單菌落，搖菌并提取質粒，分別經PCR擴增及SmaI，BamHI酶切鑒定。PCR擴增采用Taq酶，反應條件為：94℃，1分鐘→94℃，30秒，后57℃，1分鐘，然后72℃，1.5分鐘，30循環→72℃，10分鐘→4℃。DNA酶切反應條件（30μl體系）：1.0－2.0μg質粒DNA、3μl 10×T緩沖液、SmaI 1.5μl，BamHI 1.5μl，加ddH2O至終體積30μl，置30℃反應2～3小時。

2.5 重組質粒測序 重組后的質粒進行測序，核對為反義基因SS且序列正確無誤。

2.6 目的基因與超表達載體的酶切 經測序后確認SS無誤后，將pMD18－SS質粒和PBI121質粒用SmaI，BamHI做雙酶切，酶切體系為（30μl體系）：1.0～2.0μg質粒DNA、3μl 10×T緩沖液、SmaI 1.5μl，BamHI 1.5μl，加ddH2O至終體積30μl，置30℃反應2～3小時。

2.7 目的基因與超表達載體的連接 經雙酶切的目的基因和表達載體，用純化試劑盒純化后，進行連接，連接體系（10μl體系）：200ng SS片段、250ng PBI121質粒，1μl 10 ×連接緩沖液、1U T4DNA連接酶，加ddH2O至終體積10μl，置16℃反應過夜。

2.8 大腸桿菌轉化與鑒定 方法同2.3和2.4。

2.9 農桿菌細胞轉化與鑒定 低溫冰箱中取出100μl感受態細胞懸液，室溫解凍，立即置冰上，加0.1μg PBI121－SSDNA溶液，輕混勻，冰上放置10分鐘。置于液氮速凍5分鐘，28℃水浴熱激5分鐘。加入500μl YEB液體培養基，28℃緩慢振蕩培養2～3小時，使細菌恢復正常生長狀態。取上述菌液100μl涂布于含Rif（50μg／m l）及Kan（25μg／m l）的YEB篩選平板上，放置30分鐘，待菌液完全被培養基吸收后，28℃培養24～48小時。經PCR擴增鑒定陽性克隆。

3 結果

3.1 青蒿SSDNA擴增 載體Prok II－SS經PCR擴增后，經10%凝膠電泳可見一條長度約1250bp的帶。由電泳結果可知，青蒿SS基因已從載體Prok II－SS中擴增出來，其大小符合理論長度。見圖1。

3.2 目的基因與載體的連接 將PCR擴增片段插入pMD18－T載體后獲得的重組質粒命名為pMD18－SS。抽取pMD18－SS的質粒做雙酶切，經1%凝膠電泳后，可見與青蒿DNA的PCR產物大小相當的區帶，表明上述擴增片段已經與載體連接。見圖2。

3.3 反義SS基因超表達載體PCR鑒定 將經過雙酶切連接重組后質粒命名為PBI121－SS，將其導入大腸桿菌DH5α后提取質粒進行PCR檢測，結果顯示SSDNA片段已擴增，說明PBI121－SS已連接成功。見圖3。

3.4 反義SS基因超表達載體雙酶切鑒定 將PBI121－SS質粒用SmaI，BamHI做雙酶切進行進一步的鑒定，結果顯示切下的片段與SS基因片段大小一致，說明PBI21－SS超表達載體已經構建成功。見圖4。

3.5 反義SS基因超表達載體轉化農桿菌鑒定 使用凍融法將PBI121－SS導入農桿菌BA4404，以農桿菌DNA為模板PCR，結果擴增出1259 bp的反義SS基因片段，說明PBI121－SS質粒已導入農桿菌。見圖5。

4 討論

目前，采用基因工程手段培育高產青蒿素品系正在受到國內外學者的關注［1－4］。國內外相繼開展了青蒿素生物合成關鍵酶基因克隆的研究，已克隆出從乙酰CoA合成FDP的關鍵酶基因，即HMG－CoA還原酶基因（HMGR）和FDP合酶基因（FDPS）。Chen等利用農桿菌轉化分別獲得轉FDPS基因青蒿發根和青蒿植株，其青蒿素含量比非轉基因青蒿植株提高了2－3倍［2－3］。由此可見，植物基因工程在青蒿素高產品系的培育上具有很大潛力。

pMD18－T Vector是一種高效克隆PCR的專用載體，由pUC18載體改建而成的，消除了pUC18載體上的多克隆酶切位點，再在pUC18載體的多克隆酶切位點處導入了EcoR V酶切位點，使用EcoR V進行酶切反應后，再在兩側的3′端添加“T”構成。克隆后的PCR產物無法將載體上的限制酶切下，需要在PCR擴增引物中導入合適的酶切位點，此時如果使用PCR擴增引物導入的酶切位點進行DNA酶切時，酶切反應將不會受T載體上其他多克隆酶切位點上的限制酶影響，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。

本次實驗在青蒿細胞中導入反義SS基因，嘗試通過干擾SS基因表達來降低類固醇合成活性［6］。因此，以雙元質粒pBI121為基礎構建反義SS基因表達載體PBI121－SS，然后利用根癌農桿菌Ti質粒衍生載體，在后續研究中將反義SS基因導入青蒿細胞并再生轉基因青蒿植株，試圖使青蒿體內的代謝活動朝著更有利于青蒿素合成的方向轉變，從而實現青蒿分子育種的目標，并為利于植物基因工程改造中藥材進行有益的探索。

［1］Paniego NB，Giulietti AM.Artemisia annua L.：Dedifferentiated and differentiated cultures.［J］.Plant Cell Tiss Org Cult，1994，36（8）：163－168.

［2］Chen DH，Liu CJ，Ye HC.et al.Ri－mediated transformation of Artemisia annua with a recombinant farnesyl diphosphate synthase gene for artemisinin p roduction［J］.Plant Cell Tiss Org Cult，1999，57（3）：157－162.

［3］Chen DH，Ye HC，LiGF.Expression of a chimeric farnesyldiphosphate synthase gene in Artemisia annua L.：Transgenic plants via Agrobacterium tumefaciens－mediated transformation［J］.Plant Sci，2000，155（5）：179－185.

［4］Han JL，Liu BY，Ye HC.Effects of overexpression of the endogenous farnesyl diphosphate synthase on the artemisinin content in Artemisia annua L［J］.J Integrat Plant Biol，2006，48（4）：482－487.

［5］王滿元.青蒿素類藥物的發展歷史［J］.自然雜志，2012，34（1）：44－47.

［6］馮麗玲.青蒿反義鯊烯合酶基因轉化培育青蒿素高產植株的研究［D］.廣州中醫院大學，2007：32－33.

R284

A

1007－8517（2013）21－0005－02

2013.09.20）

柬埔寨那塔納基里快速滅源滅瘧示范項目（KY－2011－013－4）。

羅曉莉，女，碩士，E－mail：117231216＠qq.com