環孢素A血藥濃度的HPLC測定方法

劉開友

環孢素A（Cyclosporine A，CsA）是一種強效免疫抑制劑，目前廣泛用于器官和組織移植術后的預防和治療[1]。然而CsA治療的有效血藥濃度范圍為100~450 μg/L，600 μg/L以上即有中毒危險[2]，特別是肝腎毒性明顯[3]。CsA治療窗窄，個體差異大，因此，臨床應用必須監測其血藥濃度。本實驗建立了一種簡單準確的HPLC測定CsA血藥濃度的方法，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 CsA 標準品，乙醚，正己烷，甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），Agilent 1200型高效液相色譜儀，DiamonsilTM C18色譜柱，GENIUS 6K-D離心機，XW-80A漩渦混合儀。

1.2 標準溶液的配制 精密稱取CsA標準品10.006 mg置于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，作為CsA標準品儲備（100 μg/mL）。用甲醇稀釋，分別配成2.5、5、10、25、50 μg/ml的CsA標準品溶液。

1.3 樣品的處理

1.3.1 空白血樣 取人全血1~10 ml均塞離心管中，加入1 ml 0.1 mol/L的NaOH溶液，渦旋2 min，加入5 ml乙醚，渦旋5 min，3500 r/min離心10 min，取上清液4.5 ml，40 ℃水浴吹干，加入100 μl甲醇-0.05 mol/ml鹽酸（1：1，V：V）的混合液[4]，渦旋30 s，加入250 μl正己烷，渦旋2 min，3500 r/min離心5 min，棄去正己烷，取下層溶液進樣。

1.3.2 加藥血樣 取濃度為2.5、5、10、25、50 μg/mL的CsA標準溶液各20 μl置10 ml均塞離心管中，分別加入人全血 1 ml，配置成含 CsA 50、100、200、500、1000 ng/ml血液樣品，加入1 ml 0.1 mol/L的NaOH溶液，后處理方法同“1.3.1”項下空白血樣。

1.4 色譜條件的選擇 色譜柱：DiamonsilTM C18（4.6×200 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（74：26）；流速：1 ml/min；柱溫：70 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μl。

1.5 方法專屬性 在上述色譜條件下，分別取CsA標準液，空白血樣，加藥血樣進行HPLC測定，考察其色譜圖。

1.6 標準曲線的制備 取血藥濃度為50、100、200、500、1000 ng/ml加藥樣品進行HPLC測定，以藥物濃度C與樣品峰（A）做線性回歸，制備標準曲線。

1.7 回收率 配制濃度分別為50、200、1000 ng/ml的加藥血樣，按照“1.3.1”項下的處理方法處理、測定，分別與同濃度的CsA標準溶液直接進樣的峰面積做比較，計算提取回收率即絕對回收率。配制濃度分別為50、200、1000 ng/ml的加藥血樣，按照“1.3.1”項下的處理方法處理、測定，按：“方法回收率=測得量/理論值×100%”計算方法回收率即相對回收率。

1.8 精密度 濃度分別為50、200和1000 ng/ml的加藥血樣按照“1.3.1”項下的處理方法處理，測定，一日內重復操作5次，考察其日內精密度。在隨后的5 d內，重復操作5次，考察其日間精密度。

2 結果

2.1 方法專屬性 CsA色譜圖考察結果如圖1所示，可見CsA的保留時間為7.6 min左右，空白血樣在此時間點無干擾，CsA與血液中的內源性物質分離良好。

圖1 CsA標準溶液、空白血樣、加藥血樣的色譜圖

2.2 標準曲線及線性范圍 結果如圖2所示，所得標準曲線為：A=0.0983C-1.629，R2=0.9997。

圖2 CsA血液內濃度的標準曲線

2.3 回收率 低、中、高濃度的加藥血樣的提取與方法回收率見表1。低、中、高濃度的加藥血樣的日內與日間精密度見表2。

表1 回收率試驗結果 %

表2 精密度試驗結果

3 討論

個體化給藥是臨床用藥的發展趨勢，血藥濃度監測是臨床藥學的重要任務，因此，建立高效準確，經濟適用的CsA血藥濃度監測方法意義重大。HPLC法已普遍應用于CsA血藥濃度的測量[5]，其優點是靈敏快速，缺點是樣品處理繁瑣復雜，對操作人員要求高。另外，70 ℃高溫使色譜柱使用壽命縮短[6]，經濟成本增加，但相比免疫學方法，如單克隆、多克隆熒光偏振免疫法[7-8]，酶免疫增強法[9]，MAb親和柱免疫測定法[10]等仍較經濟適用。本研究中，采用HPLC法測定環孢素A血藥濃度，發現該方法快速靈敏準確，可用于環孢素A血藥濃度的監測。

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