SELDI蛋白質芯片技術在肝癌中的應用

農世澤，黃承樂，梁林慧，馮國鋼，王獻民（廣西壯族自治區百色市人民醫院檢驗科 533000）

血清甲胎蛋白（AFP）多年來一直作為診斷肝癌的重要參考依據，但是仍不夠理想，大量臨床數據也表明肝癌患者AFP陽性率波動在60%～70%，超過30%的肝癌患者即使到了中、晚期血清AFP也表現為陰性或低濃度陽性[1－5]。此外，慢性肝炎、肝硬化患者中AFP也有一定的陽性率[6]。因此單獨應用AFP診斷肝癌可能導致AFP陰性的肝癌患者漏診，或者AFP低濃度陽性的肝癌患者難以和一些肝臟良性疾病相鑒別。表面增強激光解吸電離飛行時間質譜（SELDI－TOF－MS）技術是近年發展起來的一種蛋白組學研究方法，以這一技術為基礎開發的蛋白質芯片可以非特異性或特異性地結合被測樣本中的各種蛋白質，進而篩選疾病不同階段時期的特異性相關蛋白質，能提高疾病的臨床診斷效率的疾病診斷。基于SELDITOF－MS技術的巨大優勢和AFP低濃度陽性時鑒別肝癌的局限性，設計了以下實驗。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以13.2μg/L＜AFP≤400μg/L判為AFP低濃度陽性，肝癌組共28例，男20例，女8例，平均年齡為（53.1±7.3）歲；肝病組共34例，男25例，女9例，其中慢性肝炎患者22例，慢性肝炎后肝硬化患者12例，平均（47.1±9.7）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品檢測 取血清10μL，加入2倍體積U9緩沖液稀釋。將30μL上述變性后樣品加入360μL結合緩沖液（50 mM乙酸鈉，pH4.0）。將CM10蛋白芯片裝入生物芯片處理器，每孔加入100μL樣品，振蕩1h。每孔加入200μL結合緩沖液，振蕩5min，甩去液體，加入緩沖液重復操作一次，每孔加入羥乙基哌嗪乙磺酸200μL，立刻甩出。取出芯片，待干后，每孔加三氟乙酸0.5μL，自然干燥，上機測定。

1.2.2 數據采集 采用蛋白芯片生物系統Ⅱ－c型蛋白芯片閱讀儀讀取芯片信息。芯片閱讀儀參數設置如下：激光強度180，檢測靈敏度8，優化范圍為質荷比（m/z）2 000～10 000。采用Ciphergen ProteinChip Software 3.2版本的分析軟件自動采集數據，信噪比（S/N）大于5為有效波峰。

1.3 統計學方法 圖譜標準化后用Biomarker Wizard軟件計算各蛋白峰在組間差異的P值，用Biomarker Patterns Software軟件對差異蛋白峰值做線性分類分析，最后構建診斷模型。

2 結 果

2.1 差異蛋白峰的篩選 28例AFP低濃度陽性肝癌患者和34例AFP低濃度陽性肝病患者血清的原始蛋白指紋圖譜經同樣處理，在m/z 2 000～50 000范圍內共檢測到39個蛋白峰，其中29個蛋白峰兩組差異有統計學意義（P＜0.05）。與AFP低濃度陽性肝病組相比，AFP低濃度陽性肝癌組血清中有5個蛋白峰上調，24個蛋白峰下調，見表1。

表1 29個蛋白峰在兩組蛋白指紋圖譜的Mean數據比較

2.2 診斷模型的建立與驗證診斷模型 由BPS完成，通過對原始圖譜的初步判斷，從篩選出的29個差異蛋白峰中選擇m/z為6 452的蛋白峰得到一個比較合理的決策樹模型（診斷模型）。該模型區分AFP陽性肝癌患者與AFP陽性肝病患者的準確率為85.5%（53/62），靈敏度為82.1%（23/28），特異度為88.2%（30/34），陽性預測值為85.2%（23/27），陰性預測值為85.7%（30/35），陽性似然比為6.982，陰性似然比為0.202，見表2。

表2 兩組患者診斷模型的評價（n）

3 討 論

血清AFP一直被視為肝癌普查、早期診斷和療效評估的重要指標之一，但是仍不夠理想，有30%～40%的肝癌患者血清AFP呈陰性，其原因可能有：（1）肝癌細胞有不同細胞株，有的能合成AFP，另一些只能合成清蛋白；如后者在癌灶中比例大，血清AFP可不升高。（2）在瘤體直徑小于3cm的小肝癌患者中，AFP可正常或輕度升高。（3）不是肝細胞癌，而是纖維板層癌或膽管細胞癌，AFP陽性極少見。因此目前迫切需要發展能用于臨床血清AFP陰性或低濃度陽性肝癌的診斷標志物。

研究表明，血液中可能含有大量從未被發現的可作為疾病標志物的多肽[7]。這是因為疾病早期及不同的發展階段在蛋白水平上就可表現出細微但重要的變化[8]。分析這些早期發生的蛋白質變化，有望獲得臨床早期診斷的生物學標志物。SELDI－TOF－MS技術是蛋白質學研究的一項全新技術，具有高通量、高靈敏度和重復性好等特點，克服了雙向電泳、光譜及其他質譜等技術存在的缺點，目前已應用于多種腫瘤早期診斷的研究。本文期望建立能通過SELDI－TOF－MS技術與血清AFP低濃度陽性結果聯合使用從而在整體上提高肝癌的臨床診斷效率的疾病診斷模型。應用SELDI－TOF－MS技術，本文發現了29個具有統計學意義的差異蛋白峰，其中在AFP低濃度陽性肝癌組血清中有5個蛋白峰上調，24個下調，對這些差異蛋白峰的研究將有助于解決血清AFP低濃度陽性肝癌患者與血清AFP低濃度陽性肝病患者不容易鑒別的問題。在后續的驗證實驗中，以m/z為6 452的蛋白峰建立的診斷模型，對血清AFP陽性肝癌患者與AFP陽性肝病患者的準確率為85.5%，靈敏度為82.1%，特異度為88.2%，陽性預測值為85.2%，陰性預測值為85.7%，陽性似然比為6.982，陰性似然比為0.202。該模型能較好地區分血清AFP陽性肝癌患者與血清AFP陽性肝病患者，聯合血清AFP檢測可以有助于肝癌的診斷和鑒別診斷。

由于疾病本身的復雜性和個體差異的影響，以及實驗研究過程中的種種影響因素，經研究得出的診斷模型，其實用價值的實現尚需要經過實驗條件的進一步優化和規范化以及多中心大樣本的驗證研究才能得以完成。盡管目前SELDI－TOFMS蛋白質芯片系統存在許多不足，但至今為止仍是高通量系統檢測蛋白質多樣性的惟一技術平臺，隨著蛋白質芯片技術的不斷完善與進步，它將使蛋白質在肝癌發生、發展中作用的研究取得一系列重大突破，為人類的健康事業作出巨大貢獻。

[1] Spangenberg HC，Thimme R，Blum HE.Serum markers of hepatocellular carcinoma[J].Semin Liver Dis，2006，26（4）：385－390.

[2] Trevisani F，D′intino PE，Morselli－Labate AM，et al.Serum alpha－fetoprotein for diagnosis of hepatocellular carcinoma in patients with chronic liver disease：influence of HBsAg and anti－HCV status[J].J Hepatol，2001，34（4）：570－575.

[3] Giardina MG，Matarazzo M，Morante R，et al.Serum alpha－L－fucosidase activity and early detection of hepatocellular carcinoma：aprospective study of patients with cirrhosis[J].Cancer，1998，83（12）：2468－2474.

[4] Marrero JA，Su GL，Wei W，et al.Des－gamma carboxyprothrombin can differentiate hepatocellular carcinoma from nonmalignant chronic liver disease in American patients[J].Hepatology，2003，37（5）：1114－1121.

[5] Tsai JF，Jeng JE，Chuang LY，et al.Serum insulin－like growth factor－II as a serologic marker of small hepatocellular carcinoma[J].Scand J Gastroenterol，2005，40（1）：68－75.

[6] Daniele B，Bencivenga A，Megna AS，et al.Alpha－fetoprotein and ultrasono－graphy screening for hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterology，2004，127（5Suppl l）：S108－S112.

[7] Liotta LA，Ferrari M，Petricoin E.Clinical proteomics：written in blood[J].Nature，2003，425（6961）：905.

[8] Liotta LA，Kohn EC.The microenvironment of the tumourhost interface[J].Nature，2001，411（6835）：375－379.