苦參堿對慢性萎縮性胃炎模型大鼠胃黏膜的保護作用

董 燕，李銀霞，嚴 祥

(1連云港市第二人民醫院，江蘇連云港222000;2蘭州大學第一醫院)

苦參堿是從苦豆子中提取的一種生物堿，可用于抗病毒、某些癌癥、炎癥、殺蟲、抗纖維化和心臟疾病。研究表明，苦參堿具有免疫調節功能，能夠降低IL-4［1］、轉化生長因子-β1(TGF-β1)［2］、增殖細胞核抗原(PCNA)［3］、B 細胞白血病/淋巴瘤-2(Bcl-2)［4］的表達，抑制巨噬細胞和淋巴細胞活性。研究顯示，在慢性萎縮性胃炎(CAG)患者胃組織中，PCNA［5］、Bcl-2蛋白［6］和 TGF-β1表達增高。2007 ～2009 年，我們從分子表達和病理變化的角度探討了苦參堿對CAG模型大鼠胃黏膜的保護作用，旨在為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 材料 清潔級Wistar大鼠53只，體質量(144±3)g，購自蘭州軍區蘭州總醫院。主要試劑:IL-4、INF-γ、PCNA、Bcl-2、TGF-β1ELISA 試劑盒 (美國ADL公司);乙醇(天津市百世化工有限公司);水楊酸鈉(天津化學試劑一廠);N-甲基-N-硝基-亞硝基胍［MNNG，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司］;氨水(白銀良友化學試劑有限公司);葉酸(天津飛鷹制藥有限公司)，用蒸餾水稀釋至40 mg/kg;苦參堿(蘭州大學第一醫院藥劑科，純度98%)，用蒸餾水稀釋至180 mg/kg。

1．2方法

1．2．1 模型制作與給藥 53只大鼠適應性喂養1周后隨機分為模型組19只、葉酸組12只、苦參堿組11只、正常組12只。正常組自由飲食，同時以模型組等量自來水灌胃。CAG模型制作方法:大鼠第2周第1、2天給予20 mmoL/L去氧膽酸鈉自由飲用，飽食，從第3天開始飽食1 d禁食1 d，禁食當天下午以40%乙醇與2%水楊酸鈉交替灌胃2．5 mL/d。第3周開始飽食2 d禁食1 d，禁食當天下午以40%乙醇與2%水楊酸鈉交替灌胃，2．5 mL/d，共3周，此為造成胃黏膜的淺表性炎癥以刺激胃黏膜修復。第6周開始每周三、周日禁食，禁食當天下午以40%乙醇與2%水楊酸鈉交替灌胃，2．5 mL/d，其余時間飽食，同時將100μg/mL MNNG裝在涂漆瓶中自由飲用至16周末。第17周每天給予0．1%的氨水自由飲用，每周以60%乙醇與2%水楊酸鈉交替灌胃2次/周，直到24周造模結束。因受實驗條件的限制大鼠未分籠飼養，造模期間因相互攻擊死亡19只，其中模型組11只、正常組2只、苦參堿組3只、葉酸組3只。所有死亡大鼠分別在胃竇與胃體交界處和病變明顯處各取一小塊長方形組織做病理切片觀察，其中模型組6只有腸上皮化和萎縮，表明造模成功。第25周開始給藥，葉酸組給予葉酸40 mg/(kg·d)灌胃，苦參堿組給予苦參堿180 mg/(kg·d)灌胃，正常組和模型組給予等量自來水灌胃，1次/d，共45 d。治療期間模型組、葉酸組、正常組各死亡1只，苦參堿組死亡3只。

1．2．2 標本采集方法 實驗結束后所有大鼠禁食24 h，稱體質量，戊巴比妥鈉麻醉取胃，沿胃大彎切開，用生理鹽水沖洗，分別在胃竇和病變明顯處取3 mm×10 mm的長方形組織，一部分用10%甲醛固定，石蠟包埋，用于病理檢查;另一部分－80℃冷凍，用于蛋白含量檢測。

1．2．3 病理評分方法 取胃組織石蠟標本，梯度乙醇脫水，0．4μm連續垂直切片3張，顯微鏡下觀察。評分標準:①炎性細胞:無炎性細胞計0分，有中性粒細胞計1分，有淋巴細胞計2分，有單核細胞計3分，嗜酸性粒細胞計4分。②炎癥程度:無炎癥計0分，在胃黏膜表層或底部有少量散在的炎細胞計1分，在胃黏膜各部分均有較多的炎細胞計2分，炎細胞遍布黏膜全層或形成淋巴小結或成堆聚集計3分。③胃黏膜糜爛:無糜爛計0分，被覆上皮細胞淺表損害計1分，胃小凹以上損害計2分，黏膜小凹以下損害計3分。④非典型增生:無增生計0分，累及胃黏膜上皮層的下1/3計1分，累及胃黏膜上皮層的下2/3計2分，累及上皮層2/3以上但未達到全層計3分。⑤腸上皮化生:無計0分，有計1分。⑥核分裂:無計0分，有計1分。

1．2．4 蛋白含量檢測 取胃組織冷凍標本，采用考馬斯亮藍法檢測胃黏膜組織中 INF-γ、IL-4、TGF-β1、Bcl-2、PCNA蛋白含量，具體操作方法按ELISA試劑盒說明書進行。計算公式:蛋白含量(mg·prot/mL)=(測定管OD值－空白管OD值)/［(標準管OD值－空白管OD值)×蛋白標準濃度］。

1．2．5 統計學方法 采用SPSS10．0統計軟件，體質量和生化指標檢測結果以ˉx±s表示，病理指標采用平均次表示。所有資料都屬于非正態分布，病理指標采用多組有序變量資料的秩和檢驗進行分析，各組蛋白表達先采用多組連續變量資料的秩和檢驗進行分析，有意義的再進行兩組連續變量資料的秩和檢驗進行兩兩比較，并采用Spearman等級相關分析對模型組各指標進行相關性分析。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 各組病理學檢查結果比較 肉眼觀察到各組胃黏膜均有充血，偶有少量點狀出血，組間比較無明顯差異。顯微鏡下可見正常組胃黏膜上皮完整，上皮細胞排列整齊，無脫落或缺損，固有膜腺體形狀規則，受浸潤的細胞主要為嗜酸性粒細胞。模型組胃黏膜不完整，可見不同程度的變性或壞死的脫落細胞，胃組織受浸潤的炎細胞有淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和少量單核細胞，其中以淋巴細胞為主，胃黏膜腺體也有不同程度的減少和腸上皮化生。苦參堿組胃黏膜受浸潤的炎細胞主要為嗜酸性粒細胞，且受浸潤的炎細胞數量顯著低于模型組和葉酸組。各組病理檢測評分結果見表1，光鏡下大鼠胃黏膜切片見圖1。

表1 各組病理檢測評分結果比較(分)

圖1 HE染色光鏡下各組胃黏膜切片

2．2 各組胃黏膜 IL-4、PCNA、Bcl-2、INF-γ、TGF-β1蛋白水平比較 見表2。與正常組比較，模型組胃黏膜 PCNA、Bcl-2、INF-γ、TGF-β1蛋白含量增加(P均＜0．05);與模型組比較，苦參堿組胃黏膜PCNA、Bcl-2、INF-γ、TGF-β1蛋白含量顯著減少(P 均 ＜0．05)。

表 2 各組胃黏膜 PCNA、Bcl-2、INF-γ、IL-4、TGF-β1表達水平比較(mg·prot/mL ±s)

表 2 各組胃黏膜 PCNA、Bcl-2、INF-γ、IL-4、TGF-β1表達水平比較(mg·prot/mL ±s)

注:與模型組比較，#P ＜0．05

組別 n PCNA Bcl-2 INF-γ IL-4 TGF-β1模型組 8 153．1 ±38．7 124．9 ±20．8 28．0 ±5．6 160．7 ±59．4 229．0 ±79．5葉酸組 9 54．1 ±21．1#66．0 ±15．9#17．2 ±3．5#128．4 ±40．0 134．6 ±44．0#苦參堿 8 54．4 ±14．5#81．3 ±21．9#15．6 ±6．0#130．0 ±29．6 132．3 ±48．3#正常組 8 39．8 ± 8．0#71．4 ±13．9#17．1 ±4．3#119．2 ±41．2 113．6 ±68．9#

3 討論

CAG是最常見的癌癥相關性死亡的原因之一［7］。CAG的發生與Hp感染、自身免疫機制和遺傳因素、十二指腸反流、胃黏膜損傷因子(如乙醇、高鹽、長期服用非甾體類抗炎藥物)等有關。由于長期慢性炎癥，導致腺體破壞而減少，黏膜變薄，在內窺鏡下表現為胃黏膜血管顯露。通常胃黏膜萎縮伴隨胃纖維組織、淋巴濾泡和黏膜肌層的化生和增生，因此有時胃黏膜呈現粗糙和顆粒狀的外觀。CAG與胃癌尤其是腸型胃癌［8］呈顯著正相關。本研究模擬人的發病因素，采用綜合造模法成功復制了CAG、腸上皮化生的動物模型。結果顯示，經苦參堿治療后，各組體質量及胃黏膜充血無統計學差異，這可能與疾病早期及大鼠自身胃黏膜存在較強的修復能力有關;但苦參堿可以減輕或控制大鼠胃黏膜炎癥、萎縮和非典型增生的程度，尤其在控制炎癥方面強于葉酸;另外，苦參堿組PCNA、Bcl-2、INF-γ、TGF-β1蛋白表達水平顯著低于模型組。

Bcl-2作為一種凋亡抑制基因，其過度表達可抑制細胞程序性死亡，在65%伴有腸上皮化生的萎縮性胃炎和81%不典型增生上皮中可見到Bcl-2蛋白表達。PCNA又稱為周期蛋白，是DNA多聚酶δ的一種輔助因子。靜止細胞含量很少，G1晚期開始增多，S期達到高峰，G2期、M期含量較低，是評價細胞增殖狀態的重要指標。研究顯示，胃黏膜發生腸化生前，細胞凋亡指數和增殖指數均呈遞增趨勢，細胞凋亡與細胞增殖呈正相關，凋亡與增殖比接近1，但到腸化生、不典型增生、胃癌時期，細胞凋亡指數逐漸降低，而細胞增殖仍呈遞增趨勢，細胞凋亡與細胞增殖呈負相關，凋亡與增殖比小于1。由淺表性胃炎向 CAG、腸化生、非典型增生、胃癌演變過程中，Bcl-2和PCNA蛋白表達陽性率逐漸增加。TGF-β1在增殖活躍的細胞中和纖維增生組織中表達較高。TGF-β1蛋白的表達隨非化生性萎縮性胃炎萎縮程度的增加而呈上升趨勢，提示TGF-β1可能在非化生性萎縮性胃炎的發展過程中起重要作用。

本研究顯示，模型組 PCNA、Bcl-2、TGF-β1、INF-γ蛋白表達水平顯著高于正常組，與以往文獻［9］報道相符。其機制可能為:CAG發生時，機體反射性引起細胞增殖相關分子的表達，而凋亡基因也處于活躍狀態，故基因調節極不穩定，易導致CAG向非典型增生和胃癌進展。本研究證實，模型組非典型增生的程度明顯高于正常組，經苦參堿治療后PCNA、Bcl-2、TGF-β1、INF-γ 蛋白的表達和非典型增生的程度明顯下降。推測苦參堿可能通過降低PCNA、Bcl-2、TGF-β1的表達控制 CAG 引起的反射性細胞增殖程度，從而防止基因調節失控致其向胃癌進展。另外，CAG多伴有纖維組織增生變化，而TGF-β1是調節纖維增生的重要因子，苦參堿可能具有降低該因子的表達而減輕這種病理變化的作用。INF-γ是介導慢性炎癥細胞免疫最主要的因子，而IL-4是介導慢性炎癥體液免疫最主要的因子。理論上，CAG是以淋巴細胞浸潤為主，本研究也證實了模型組胃黏膜受浸潤的炎性細胞主要為淋巴細胞，其次有少量中性粒細胞，并且模型組INF-γ的表達顯著高于正常組，而IL-4的表達卻無明顯統計學差異，經苦參堿治療后INF-γ水平下降，淋巴細胞和中性粒細胞浸潤程度也顯著低于模型組和葉酸組。說明苦參堿可能通過降低INF-γ表達來控制胃黏膜炎癥反應程度。此外，病理檢查發現，胃黏膜嗜酸性粒細胞較多，但正常組胃黏膜也有大量嗜酸性粒細胞，這可能是大鼠與人CAG病理變化不一致的地方。實驗過程中發現，苦參堿組嗜睡，精神狀態明顯不如其他組，且胃黏膜充血糜爛程度高于其他組，這可能與苦參堿具有中樞抑制作用和胃黏膜刺激性有關。

綜上所述，苦參堿可通過降低 PCNA、Bcl-2、INF-γ、TGF-β1的表達緩解胃黏膜炎性細胞浸潤的程度，從而阻止CAG向胃癌進展。苦參堿在CAG炎癥控制和防止其向胃癌進展方面療效較好，但其不良反應、用藥劑量及療程仍有待進一步深入研究。

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