正交試驗法優選感冒藥茶顆粒的提取工藝

黃權芳* 林 興韋振源劉 倩言開武

（1 廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023；2 廣西醫科大學，廣西 南寧 530021；3 桂林醫學院，廣西 桂林 541004）

正交試驗法優選感冒藥茶顆粒的提取工藝

黃權芳1* 林 興2韋振源1劉 倩1言開武3

（1 廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023；2 廣西醫科大學，廣西 南寧 530021；3 桂林醫學院，廣西 桂林 541004）

目的 優選感冒藥茶顆粒的提取工藝，以便制備質量穩定的制劑。方法 以加水量，提取時間，提取次數為考察因素，以總黃酮及熊果酸和浸膏量為指標，采用L9（3）4正交試驗法對感冒藥茶顆粒的最佳提取工藝進行優選。結果 該制劑最佳提取工藝為加水量10倍，提取3次，每次提取時間60min。結論 該提取工藝合理可行，穩定可控，適用于大生產，是最佳制備工藝。

正交試驗；提取工藝；感冒藥茶顆粒

感冒藥茶顆粒是由廣西中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑感冒藥茶的基礎上進行的劑型改革。方源于我院民間科醫生的經驗方，由桑葉、菊花、薄荷、山芝麻、崗梅根等藥材組成。具有清熱解毒，平肝明目，解熱抗炎的功效，能緩解感冒引起的發燒咽痛、周身骨痛、頭重乏力、胸悶食滯、惡心嘔吐等癥狀，對風熱挾濕證感冒的臨床療效確切，無毒副反應，值得臨床推廣應用。由于茶劑在制備過程中微生物不易控制及儲存過程中揮發性成分易揮發和藥粉滲出污染濾袋而影響外觀等缺點，本課題組嘗試在此基礎上進行劑型改革，將其開發研制成顆粒劑，這樣保持了煎劑的優點，又省去煎煮的麻煩，服用方便，也符合感冒用藥特點，又便于攜帶與保存，無霉變之慮，發揮著中醫中藥辨證論治在防治外感疾病方面的優勢作用。在進行劑型改造的過程中，顆粒的提取工藝研究是本課題的組成部分之一。由于處方中各藥材的主要有效成分以總黃酮、熊果酸等的含量較為顯著，同時還要考慮顆粒的成型，我們采用正交試驗法以總黃酮及熊果酸含量，浸膏得率為考察指標，對提取工藝進行了優選，以確定新劑型的最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），GH-252電子分析天平（日本A&D公司）；藥材（廣西柳州市神農中藥飲片廠），經廣西中醫大學中藥鑒定教研室騰建北副教授鑒定符合《中國藥典》2010年版一部各品種項下標準。蘆丁對照品（批號：100080-200707中國藥品生物制品檢定所），熊果酸對照品（批號：110742-200518中國藥品生物制品檢定所），崗梅根對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，121152-200502）水為純化水，所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 單因素試驗

本實驗采用加水煎煮進行提取，以總黃酮為指標，分別考察了加水量、提取時間、提取次數等因素對提取率的影響。

2.1.1 加水量對提取率的影響，加水量為10倍時提取率最高。

2.1.2 提取時間對提取率的影響，提取時間為60min時提取率最高。

2.1.3 提取次數對提取率的影響，提取次數為3次時提取率最高。

2.2 正交試驗設計

根據傳統工藝采用水煎煮，浸泡時間為30min。依據單因素試驗的結果，以加水量（A）、提取次數（B），提取時間（C）、為考察因素，以總黃酮含量、熊果酸含量、浸膏得率為綜合評價指標，采用L9（3）4正交設計安排試驗，工藝水平安排見表1。

表1 正交試驗因素表

2.3 樣品提取液的制備

按照處方配比1/5量稱取藥材，共9份，提取前均浸泡30min，按正交試驗表安排實驗進行提取，合并提取液，濾過，合并濾液濃縮定容至1000mL，得感冒藥茶提取液，備用。

2.4 總黃酮含量的測定[1-3]

2.4.1 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品6.8mg，置于25mL的容量瓶中，加70%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度線，搖勻，得蘆丁對照品溶液（272μg/mL），備用。

2.4.2 樣品溶液的制備

精密吸取提取液2mL，水浴蒸干溶劑，加適量70%乙醇溶解，轉移至25mL容量瓶內，加70%乙醇至刻線，搖勻，得感冒藥茶樣品溶液，備用。

2.4.3 黃酮測定波長的選擇

精密吸取蘆丁對照品溶液2.0mL置于25mL容量瓶中，加水至6mL，精確加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，混勻，放置6min；精確加入10%氯化鋁溶液1mL，搖勻，放置6min；精確加入4.3%氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度線，搖勻，放置15min。

精確吸取感冒藥茶樣品溶液2.0mL，置于25mL容量瓶內，加水至6mL，精確加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min；精確加入10%氯化鋁溶液1mL，搖勻，放置6min；精確加入4.3%氫氧化鈉試液10mLl，再加水至刻線，搖勻，放置15min。

用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計在200nm～900nm波長范圍內掃描，結果對照品溶液與樣品溶液在515nm處均有最大吸收峰，故選擇515nm為測定波長。

2.4.4 蘆丁標準曲線的制備

精密吸取蘆丁對照品溶液0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL分別置于25mL容量瓶中，各加水6mL，精確加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，混勻，放置6min；精確加入10%氯化鋁溶液1mL，搖勻，放置6min；精確加入4.3%氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻線，搖勻，放置15min，以試劑為空白，照分光光度法試驗，于515nm的波長處測定吸收度，以吸收度A為縱坐標，濃度C為橫坐標，繪制標準曲線，得標準曲線：C=102.1495A+3.0132（R2=0.9986）。蘆丁在5.44～54.40μg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.4.5 精密度試驗

精密吸取同一蘆丁對照品溶液2mL共5份，分別置于不同的25mL容量瓶中按 “2.4.3”項下，從“各加水至6mL……”起操作，測定吸光度，結果蘆丁標的平均吸光度A為0.1769，RSD為1.48%（n=5）。

2.4.6 重現性試驗

精密移取同一批號的樣品溶液2mL共5份，按“2.4.3”項，從“分別置于25mL容量瓶中”起操作，測定每個容量瓶中的總黃酮濃度，結果總黃酮的平均濃度為35.64μg/mL-1，RSD為0.18%（n=5）。

2.4.7 穩定性試驗

按照“2.4.3”項下方法制備感冒藥茶樣品供試溶液，用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計于室溫（26℃）下每隔10min測定一次總黃酮的濃度，結果吸光度A在50min內無明顯變化，RSD為 2.9264%，表明在顯色后50min內穩定性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗

精密移取總黃酮濃度為12.734ug/mL的樣品溶液5份，每份0.5mL，水浴蒸干，用70%乙醇溶解，轉移至25mLl容量瓶中，再分別加入濃度為400μg/mL的蘆丁對照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL，按照“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，測定其總黃酮濃度。平均回收率為107.56%，RSD為2.62%。

2.4.9 感冒藥茶樣品總黃酮的含量測定

精密吸取樣品2mL，水浴蒸干溶劑，加適量70%乙醇溶解，轉移至25mL容量瓶內，加70%乙醇至刻線，搖勻備用。

精確吸取上述溶液2mL共3份，分別置于不同的25mL容量瓶內，各加水至6mL，精確加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min；精確加入10%氯化鋁溶液1mL，搖勻，放置6min；精確加入4.3%氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻線，搖勻，放置15min，在515nm處測定吸光度A，計算含量，取平均值。

2.5 熊果酸的含量測定

2.5.1 樣品溶液的制備

取感冒藥茶樣品溶液0.2mL水浴揮干溶劑，在60℃的烘箱中除去水汽，精密加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3mL，高氯酸1.0mL，于60℃水浴中反應15min，立即置于冰浴中冷卻，精確加入冰醋酸5.0mL，搖勻，既得。

2.5.2 崗梅根對照藥材溶液的制備[4]

稱取崗梅根對照藥材3.3g，加水100mL水提取3次，每次1h，過濾，濃縮至100mL得崗梅根對照藥材溶液，取0.2mL水浴揮干溶劑，在60℃的烘箱中除去水汽，精密加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3mL，高氯酸1.0mL，于60℃水浴中反應15min，立即置于冰水中冷卻，精確加入冰醋酸5.0mL，搖勻，既得。

2.5.3 熊果酸對照品溶液制備

精密稱取熊果酸對照品5.5mg，置于25mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻線，搖勻，得熊果酸對照品溶液（220μg/mL）。

2.5.4 測定波長的選擇[5]

精密吸取熊果酸對照品溶液0.5mL置于試管中，水浴揮干溶劑，在60℃的烘箱中除去水汽，精密加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3mL，高氯酸1mL，于60℃水浴中反應15min，立即置于冰水中冷卻，精確加入冰醋酸5mL，搖勻，既得。

A.用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計在400nm～800nm波長范圍內掃描，結果熊果酸對照品溶液、崗梅根對照藥材溶液與感冒藥茶樣品溶液在550nm處均有最大吸收峰，故選擇550nm為測定波長。

2.5.5 熊果酸標準曲線的制備

精密吸取熊果酸對照品溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL分別置于試管中，按“2.5.1”項下，從“水浴揮干溶劑……”起操作，以試劑為空白，照分光度法（《中國藥典》2010版一部：附錄ⅦA）試驗，于550nm的波長處測定吸收度，以吸收度A為縱坐標，熊果酸濃度C為橫坐標，繪制標準曲線，得標準曲線：C=14.3372A+0.7328（R2=0.9992），熊果酸在3.49～27.94μg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.5.6 精密度試驗

精密吸取同一熊果酸對照品溶液0.3mL共5份，置于不同的試管中，按“2.5.1”項下，從“水浴揮干溶劑……”起操作，測定吸光度，結果熊果酸的平均吸光度A為0.6768，RSD為0.69%。

2.5.7 重現性試驗

精密吸取同一批號的樣品溶液0.2mL共5份，分別置于試管中，按“2.5.1”項下，從“水浴揮干溶劑……”起操作，測定每支試管中溶液的熊果酸濃度，結果熊果酸平均濃度為17.46μg/mL，RSD為1.58%。

2.5.8 穩定性試驗

按照“2.4.1”項下方法制備樣品供試溶液，用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計于室溫（26℃）下于0h，1h，2h，3h，4h，5h測定熊果酸的吸光度，RSD為1.49%，測定結果表明樣品在顯色后5h內穩定性良好。

2.5.9 加樣回收率試驗

精密移取熊果酸濃度為9.93μg/mL的樣品溶液5份，每份0.1mL，再精密加入濃度為 500μg/mL的熊果酸對照品溶液0.05mL，0.1mL，0.15mL，0.2mL，0.25mL，按照“2.5.1”項下方法制備供試品溶液，測定熊果酸平均回收率為97.69%，RSD為1.41%。

2.5.10 感冒藥茶樣品中熊果酸的含量測定

精確吸取樣品0.1mL5份于不同試管中，在水浴中揮干溶劑，后在60℃烘箱中除去水汽，精確加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3mL，高氯酸1mL，置60℃水浴中反應15min，立即置于冰水中冷卻，再精確加入冰醋酸5mL，搖勻，在550nm處測定吸光度A，計算含量，取平均值。

2.6 評分標準

方中總黃酮和熊果酸為主要成份，將測定總黃酮、熊果酸作為主要確定提取效率的總體優化指標；考慮到本品是復方制劑，為了對水煎煮工藝提取效率有個總體的控制，故增加浸膏率作為另一個工藝優化的總體指標。以3項指標為綜合評分，規定綜合評分滿分為100分，其中總黃酮、熊果酸含量分別占綜合評分的40%，以總黃酮、熊果酸含量最高為滿分分別為40分；浸膏率占綜合評分的20%，以最高者為滿分20分。

2.7 最佳工藝驗證試驗

為考察上述優選提取工藝的穩定性，按照處方配比五分之一量稱取藥材3份，浸泡30min，加水10倍，每次煎煮60min，提取3次。分別測定總黃酮的平均濃度為34.92μg/mL，RSD為0.38%；熊果酸的平均濃度為16.12μg/mL，RSD為2.55%；干膏平均得量為2.78，RSD為3.97%。結果表明：用優選的工藝條件提取，這3份藥材的提取率均達到了較高水平，且工藝穩定，適用于大生產。

3 討 論

3.1 感冒藥茶由桑葉、菊花、薄荷、山芝麻、崗梅根等藥材組成。具有清熱解毒，平肝明目，解熱抗炎的功效，能緩解感冒引起的發燒咽痛、周身骨痛、頭重乏力、胸悶食滯、惡心嘔吐等癥狀，對風熱挾濕證感冒的臨床療效確切。處方中桑葉、菊花為主要藥物，桑葉中含有豐富的槲皮素類活性成分，黃酮類化合物含量豐富。菊花中亦富含黃酮類物質，以2-苯基色原酮為基核的化合物，是一類極具有開發前景的天然有機抗氧化劑[6-8]。目前研究證實，黃酮類成分具有良好的抗菌、抗病毒的作用[9]，此外崗梅根中含有熊果酸[10]，且黃酮類及熊果酸等成分可溶于水[11]。故將總黃酮、熊果酸等作為確定提取效率的總體優化指標，采用水提取工藝，適合該制劑的實際生產。

3.2 正交設計是一種高效、快速的多因素試驗設計方法，以多個指標成分作為考察因素，可用最少的試驗次數篩選出最佳試驗條件。同時還應結合批量生產的實際，在經濟，有效的前提下確定最佳工藝。本實驗以總黃酮、熊果酸含量和浸膏率為評價指標，采用正交試驗對提取工藝進行優化。結果發現，影響提取效果最主要的因素是提取次數，其次是加水量，提取時間影響不顯著。考慮到有效成分含量與療效關系以及生產成本，確定感冒藥茶的最佳提取工藝條件為A2B3C1。提取工藝驗證試驗也得以證實，優選的最佳提取工藝具有良好的連續性、穩定性和可操作性，該實驗結果可為今后的生產提供理論指導。

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Extracting Techniques for Ganmao Yaocha by Orthogonal Text

HUANG Quan-fang1*, LIN Xing2, WEI Zhen-yuan1, LIU Qian1, YAN Kai-wu3
(1 The First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medicine University, Nanning 530023, China; 2 Guangxi Medical University, Nanning 530021, China; 3 Guilin Medical University, Guilin 541004, China)

Objective To optimize techniques for Ganmao Yaocha granule, Preparation and stability so as to the quality of preparation. Methods The amount of water, extraction time and frequency as variables, By taking the rate of extract and the total of flavonoids, ursolic as the indexes components, the extraction techniques were optimized for Compound rhubarb enema through L9（3）4orthogonal test. Results The best condition is 3 times to boil with water, each 10 times,1 hours. Conclusion The preparation technology is feasible and reliable for the manufacturing process of Compound rhubarb enema.

Orthogonal test; Extraction process; Ganmao Yaocha Granules

R285.1

B

1671-8194（2013）27-0004-03

廣西壯族自治區衛生廳項目GZYZ1204

*通訊作者