急性早幼粒細胞白血病PML維甲酸受體α融合基因定量檢測的應用價值

林 綱，陳 蕾，焦志軍（江蘇大學附屬醫院檢驗科，江蘇鎮江 212001）

急性早幼粒細胞白血病（APL）是一種特殊類型的急性白血病，約占急性髓系白血病（AML）的10%～15%，多見于成人［1－2］。95%以上的APL患者具有t（15；17）（q22；q21）染色體易位，造成APL PML維甲酸受體α融合基因（PML－RARα）基因重排，形成特異性的PML－RARα，是檢測APL微小殘留病（MRD）的重要分子標志［3］。因PML基因的斷裂點不同，可以產生3種不同的PML－RARα異構體，分別為長型（L型）、短型（S型）和變異型（V型），其中以L型和S型較常見，V型較少見［4］。本文對臨床基因診斷實驗室采用實時定量聚合酶鏈反應（RQ－PCR）檢測的12例初診APL患者PML－RARα的定量檢測結果進行回顧性分析，以探討其在APL診斷、治療、預防復發中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年2月至2012年2月于本院血液科初診的12例APL患者，其中男6例，女6例，年齡18～63歲，平均49.5歲。其中2012年2月診斷的1例新病例因初發治療完全緩解后尚未來本院復診，其余11例患者均完成預期治療方案，并從治療開始密切隨訪，隨訪時間14～50個月，平均28個月，先后共檢測融合基因106次。診斷和分期符合《血液病診斷及療效標準》（第3版）標準［5］。

1.2 骨髓PML－RARα檢測 （1）單個核細胞分離和RNA提取：應用淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限責任公司產品）分離新鮮乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝骨髓標本得到單個核細胞，根據PML－RARα熒光定量試劑盒（上海申友生物技術有限責任公司產品）說明書進行總RNA提取。（2）逆轉錄和RQ－PCR：在15μL PCR反應模板中加入含有逆轉錄酶的10μL PCR反應液，42℃37min，94℃5min，94℃15s，60℃60s，循環40次，37℃1min。反應在LightCycler PCR熒光檢測儀（德國羅氏公司產品）上進行，其中ABL基因作為內參照基因。（3）定量標準品設定：PML－RARα陽性標準品均為3×104、3×105、3×106、3×107copy/mL，ABL陽性標準品均為3×103、3×104、3×105、3×106copy/mL。（4）結果判定：陰性對照的PML－RARα循環閾值（Ct）≥38或無擴增曲線；臨界對照的濃度對數為3.83±0.50；陽性對照的濃度對數為5.83±0.50者判定為陽性。以標準品拷貝數為橫坐標，實際測得的Ct值為縱坐標得到工作曲線，將待測標本的Ct值帶入標準曲線即得到該基因的拷貝數。PML－RARα相對含量＝PML－RARα/ABL。如待測樣本中PML－RARα的Ct≥38或無擴增曲線則判為陰性；內參照基因ABL的Ct≥38或無擴增曲線則判為降解。

1.3 細胞遺傳學檢查 取患者骨髓細胞培養24h后收獲制備染色體，核型分析采用R顯帶技術，按《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN1995）》進行核型分析。

1.4 血細胞分析 采集EDTA抗凝全血，Coulter LH750全自動血細胞分析儀進行分析。

2 結 果

2.1 PML－RARα定量檢測結果 12例初發患者均為陽性，其中9 例 為 PML－RARα－L 陽性，定 量 結 果 0.010 81～3.863 63；3例為 PML－RARα－S陽性，定量結果0.032 95～0.092 89（表1）。隨訪的11例完全緩解（CR）患者長期動態檢測PML－RARα，均于誘導治療1～2個月內達到血液學緩解，其中8例一直為CR，PML－RARα持續陰性；1例L型患者PML－RARα由0.143 24（初發）→0（CR1）→0.072 03（第1次CR1后13個月出現分子生物學復發）→0.234 61（第1次CR后13.5個月血液學復發）；1例S型患者PML－RARα由0.092 89（初發）→0（第1次CR）→0.126 71（第1次CR后40個月血液學復發），1例L型患者經誘導治療2個月后雖達血液學CR，但PML－RARα－L持續陽性呈逐漸下降趨勢。

表1 12例APL患者初診檢驗結果

2.2 染色體核型分析結果 12例患者全部存在t（15；17），其中3例同時伴有其他染色體異常。1例t（15；17），＋21，＋13；1例t（15；17），Xq－；另1例t（15；17），t（1；x）（表1）。

2.3 其他實驗室檢驗結果 細胞形態學分類以顆粒增多的早幼粒細胞為主，比例為54.0%～90.5%。白細胞計數7例降低（1.0×109/L～3.8×109/L）；1例正常（4.4×109/L）；4例增高：2例L型患者分別為30.7×109/L、37.8×109/L，2例S型患者分別為74.6×109/L、88.5×109/L（表1）。

3 討 論

RQ－PCR是在普通PCR中加入能與PCR產物結合的熒光探針或熒光染料，使之熒光信號隨著擴增產物的增加而呈比例增長，儀器實時檢測每一個循環結束后的熒光強度，通過與標準曲線對比得出定量結果。從擴增到產物分析都是閉管操作，最大限度地避免了污染，無PCR后處理。應用RQ－PCR擴增PML－RARα是檢測MRD最敏感的方法。隨訪的1例L型病例使用全反式維甲酸誘導治療第1次CR后13個月時檢測PML－RARα轉為陽性（定量結果0.720 3），而與此同時骨髓細胞形態學及遺傳學分別報告CR骨髓象和正常核型，當該病例于13.5個月再次復查骨髓象報告APL復發、染色體分析出現t（15；17）時，PML－RARα－L定量檢測已高達0.234 61，超過該患者初診時的定量檢測結果（0.143 24），提示MRD檢測陽性可預示惡性血液病的全面復發，應盡早給患者行誘導治療，可避免發生血液學復發［6］。1例L型患者經誘導治療2個月后血液學CR，PML－RARα－L持續陽性，表達水平呈進行性下降趨勢；1例S型患者誘導治療第1次CR至40個月時，持續陰性的PML－RARα－S轉為陽性，定量結果為0.126 71，而此時的細胞形態學報告僅為APL復發趨勢。以上信息分別提示APL患者誘導治療后融合基因比細胞形態學、遺傳學檢測指標消失得更晚，而在復發時卻最先出現陽性。RQ－PCR是目前最精確的檢測急性白血病MRD的方法，對APL患者PMLRARa表達量的測定及動態變化監測可獲知白血病細胞是否存在和不同治療方式的治療效果［7］。

PML－RARα是APL發病學和治療學的基礎，具有高度特異性。正常情況下，PML顯示類似腫瘤抑制基因的功能，RARα則促進分化和抑制生長活性。PML－RARα編碼的蛋白既破壞了核體的正常結構，又通過與PML或其他維甲酸結合蛋白形成穩定的二聚體，從而對野生型PML和RARα等位基因起顯性負調控作用，最終導致細胞惡性轉化［3］。本文檢測的12例初發APL患者100%為PML－RARα陽性，其中L型9例（75%），S型3例（25%），與文獻［8］報道比例相仿，可能因病例數較少，本研究未發現V型陽性患者。

95%以上的APL患者有t（15；17）染色體易位，并且該易位只見于APL患者，因此t（15；17）是APL高度特異性的細胞遺傳學標志。12例APL患者100%（12/12）檢測到了t（15；17），其中25%（3/12）同時伴有其他染色體異常。該3例病例初診時融合基因的定量檢測結果均高于誘導治療后單純t（15；17）同期的定量檢測結果，提示染色體核型分析與融合基因的定量結果有一定的相關性，需進一步擴大病例來求證。不論是否有附加染色體異常，APL患者發病時的白細胞計數、骨髓早幼粒細胞比例等差異均無統計學意義。

12例APL患者初診時骨髓象早幼粒細胞增多，比例為54.0%～90.5%，有學者分析了42例APL有2例早幼粒細胞比例在50.0%以下，但幼稚細胞數量與PML－RARα的表達水平沒有相關性［9－10］。外周血白細胞總數大多表現為降低［10］，12例病例中L型和S型各有2例白細胞總數升高，且L型患者的白細胞總數明顯低于S型患者的白細胞總數。

總之，采用RQ－PCR方法跟蹤檢測PML－RARα可早期發現分子生物學復發情況，及時干預治療避免血液學復發。PML－RARα表達水平與病情進展相一致，應根據MRD水平正確評價治療效果，預測預后，制訂個體化治療方案。

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