116例多發性骨髓瘤免疫特征表型分析

劉 莉

（武漢大學中南醫院血液內科 430071）

多發性骨髓瘤（MM）是一種起源于B細胞的惡性克隆性漿細胞疾病，以骨髓中積聚大量惡性漿細胞并分泌單克隆免疫球蛋白和溶骨性病變為特征，但在臨床中許多患者不完全具備這些典型特征。隨著對MM認識的深入，骨髓瘤細胞的免疫表型特征及其對疾病的診斷、治療和預后等方面的影響越來越引起人們的重視。本實驗采用三色流式細胞術分析MM患者骨髓中骨髓瘤細胞的免疫表型特征，并分析其中CD45和CD19與臨床生物學特征的關系，為臨床明確診斷以及預后提供重要依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集武漢大學中南醫院近4年收治的MM患者116例，MM的診斷符合《血液病診斷及療效標準》的診斷標準。所有患者均進行了X線片、β2微球蛋白（β2－MG）、C反應蛋白（CRP）、血肌酐、血常規檢查。

1.2 試劑與儀器 所用單克隆抗體、溶血素、破膜劑均購自美國BD公司，包括 CD38、CD19、CD56、CD138、CD20、CD34、CD7、CD33、CD117、kappa、lambda，流式細胞儀為 Beckman FC500。

1.3 流式細胞術檢測

1.3.1 膜抗原檢測 取新鮮肝素抗凝骨髓液，調整細胞數至（4～10）×109/L，取100μL骨髓液加入單克隆抗體20μL，室溫避光孵育15min，加入溶血素溶解紅細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2遍后上機，分析50 000個骨髓瘤細胞表面抗原的表達情況。

1.3.2 胞漿抗原檢測 將調整濃度后的100μL骨髓液加入單克隆膜抗體20μL，室溫避光孵育15min，加入溶血素溶解紅細胞，PBS洗滌后加入kappa、clambda抗體避光孵育15 min，PBS洗滌2遍后上機。CD45/SSC設門，以mouse IgG1－FITC/IgG1－PE/IgG1－PerCP作為同型對照，軟件分析骨髓瘤細胞各種抗原的表達率。

1.4 判斷標準 結果判斷以細胞表面或細胞內抗原表達大于20%為陽性。

1.5 統計學方法 統計分析采用SPSS18.0軟件，數據分析采用四格表檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MM患者性別及年齡分布 116例MM患者中，男52例，女64例；男性患者平均58.7歲，女性患者平均60.1歲，差異無統計學意義（P＞0.05）。MM的平均診斷年齡為59.4歲，其中20例（17.2%）發病在70歲以上，27例（23.3%）發病在60～70歲，69例（59.5%）發病在60歲以下，60歲以下包括了20例50歲以下患者。

2.2 MM的免疫表型分析 116例MM中，CD38陽性率為100.0%，CD138陽性率也較高，達96.6%，其次陽性率由高到低分別為 CD33（70.0%）、CD56（60.7%），CD117（25.6%），CD19和CD20的陽性率較低，均低于20.0%，CD7和CD34均為陰性表達，κ輕鏈型占34.5%，λ輕鏈型占48.3%。與典型的MM免疫表型不同，有17.2%的病例CD45陽性，但熒光強度較正常漿細胞有所減弱。12例患者CD19陽性或弱陽性，需要同正常漿細胞鑒別。CD45與臨床分期有關，陽性時分期較好。CD45與貧血、腎損害無關；與CD45陰性組相比，CD45陽性組骨破壞發生率較低，β2－MG、CRP水平較低。CD19與臨床分期有關，陽性時分期較差。CD19陽性組更易發生貧血，微球蛋白、C反應蛋白水平較高，骨破壞、腎損害的發生率與CD19陰性組相比差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 CD45、CD19與臨床相關表現的關系

3 討 論

本研究結果顯示，116例MM患者中，男性占44.2%，女性占55.8%，女性略高于男性，男女發病年齡未見明顯差異，其中20例發病于50歲以下，平均診斷年齡為59.4歲，高于文獻報道的平均發病年齡65歲，提示MM發病有逐漸年輕化的趨勢。

多參數流式細胞術能對單個細胞進行多個抗原檢測，可同時對細胞表面和細胞內抗原進行分析，并且其表達水平可以定量，因此流式細胞術能很好地識別并呈現骨髓瘤細胞的各種特征。通過檢測細胞表面抗原表達的強弱、異常抗原的出現及細胞內免疫球蛋白的輕鏈限制性有無，可以把骨髓瘤細胞和正常漿細胞區別開來。正常漿細胞強表達CD38和CD27，表達CD138，無輕鏈限制性，CD45和CD19與正常成熟B細胞相比表達較弱，不表達CD56、CD117、CD28，不表達B系抗原CD20、CD22。典型的MM細胞免疫分型特點為：異常表達CD28、CD117、CD20、CD56、CD13、CD33；CD27和 CD38表達減弱，CD19和CD45不表達，有輕鏈限制性。本研究與上述結論一致，但其中有10.4%的患者表達CD19，17.2%的患者表達CD45，與秦燕等［1］的結果較為一致，國外有報道骨髓瘤細胞CD45陽性率達到了31.0%［2］，可能與人種差異有關。這些結果顯示少部分MM患者的免疫表型不典型，需結合CD38、CD56、kappa、lambda等抗原的表達情況與正常漿細胞鑒別。這些免疫表型異質性的發現提示，骨髓瘤細胞的克隆可能經歷一定程度的分化與成熟，上述標志物在早期或漿母細胞中可能會出現陽性［3］。

CD45和CD19對于MM患者是否有預后意義，近年來國外學者有過一些探索。Moreau等［2］對95例MM患者進行研究發現，漿細胞上缺失了CD45的患者生存期更短。Asosingh等發現CD45陰性瘤細胞的小鼠骨髓中都出現了彌漫性瘤細胞浸潤，其血管內皮細胞生長因子mRNA水平是CD45陽性瘤細胞的4倍多，提示病情進展。MM患者中，CD45或CD19陽性的比例較低，且因為樣本數少的限制，目前國內還沒有它們與臨床分期及臨床生物學指標關系的報道。本研究結果發現，骨髓瘤中漿細胞上的CD45表達與臨床分期有關，CD45陽性組分期較好，與CD45陰性組相比，骨破壞發生率更低，β2－MG、CRP水平較低，貧血、腎損害的發生率則無明顯差異。CD45陽性組14q32染色體易位發生率較低，如t（4；14），t（14；16）等［2］，該染色體異常是多 MM 復發和預后的重要因素［5］。Akt/PI3K通路參與了骨髓瘤細胞的增殖，當CD45陽性時，Akt不能活化，影響了骨髓瘤細胞的增殖，這些可能是CD45陽性者預后較好的內在機制［6］。

CD19是相對分子質量為95×103的糖蛋白，與B細胞的活化調節和發育調節相關，是在B細胞分化早期階段后天獲得的一個標記物，在B細胞成熟期間出現，在正常骨髓漿細胞大多數中仍然表達。CD19陽性患者數量較少，但是與CD19陰性患者相比，CD19陽性患者預后較差，無進展生存期和整體存活期，大約分別短1年和2年。Rawstron等［7］分析了587例經統一方案化療后接受移植的MM患者，結果顯示缺乏CD56表達，過表達CD19、CD28提示預后不良。本研究結果顯示，CD19與臨床分期有關，陽性時分期較差。CD19陽性時，β2－MG、CRP水平較高，更易發生貧血，與骨破壞、腎損害無關。β2－MG、CRP、分期等臨床指標都是MM的預后因素，因此，CD45和CD19的表達情況與預后有一定的相關性，其發生機制還需要進一步的探索。

免疫表型檢測是鑒別MM和其他漿細胞良性增生的重要手段，可以彌補形態學的不足。本研究通過對116例MM患者的免疫表型特征進行分析，了解MM的表型特點并分析了CD45、CD19和臨床分期及臨床生物學指標的關系，為此類疾病的診斷、治療、預后評價等提供新的依據，并研究CD45和CD19的表達與骨破壞、腎損害、β2－MG、CRP、貧血等之間可能存在的關系和臨床治療方案，減少患者痛苦及經濟負擔提供了一條新的線索。

［1］ 秦燕，丁潤生，陸偉，等.多參數流式細胞術在多發性骨髓瘤診斷中的價值［J］.交通醫學，2009，23（2）：137－138.

［2］ Moreau P，Robillard N，Avet－Loiseau H，et al.Patients with CD45negative multiple myeloma receiving high－dose therapy have a shorter survival than those with CD45 positive multiple myeloma［J］.Haematologica，2004，89（5）：547－551.

［3］ Pérez－Andrés M，Almeida J，Martín－Ayuso M，et al.Clonal plasma cells from monoclonal gammopathy of undetermined significance，multiple myeloma and plasma cell leukemia show different expression profiles of molecules involved in the interaction with the immunological bone marrow microenvironment［J］.Leukemia，2005，19（3）：449－455.

［4］ Asosingh K，De Raeve H，Menu E，et al.Angiogenic Switchduring 5T2MM murine myeloma tumorigenesis：role ofCD45heterogenecity［J］.Blood，2004，103（8）：3131－3137.

［5］ Trcic RL.Cytogenetics of multiple myeloma［J］.Coll Antropol，2010，34（1）：41－44.

［6］ Descamps G，Pellat－Deceunynck C，Szpak Y，et al.The magnitude of Akt/phosphatidylinositol 3′－kinase proliferating signaling is related to CD45expression in human myeloma cells［J］.J Immunol，2004，173（8）：4953－4959.

［7］ Rawstron AC，Orfao A，Beksac M，et al.Report of the European myeloma network on multiparametric flow cytometry in multiple myeloma and related disorders［J］.Haematologica，2008，93（3）：431－438.