內鏡超聲引導下植入緩釋吉西他濱進行胰腺組織間化療的動物實驗研究

李瑜斐 孫思予 葛 楠 王樹朋

（沈陽市紅十字會醫院消化內科，遼寧 沈陽 110013）

內鏡超聲引導下植入緩釋吉西他濱進行胰腺組織間化療的動物實驗研究

李瑜斐 孫思予 葛 楠 王樹朋

（沈陽市紅十字會醫院消化內科，遼寧 沈陽 110013）

目的探尋超聲內鏡引導下的緩釋吉西他濱組織間化療在豬的胰腺的安全性和可行性。方法在超聲內鏡引導下將19G穿刺針刺入豬的胰腺組織中，通過穿刺針將能夠緩慢釋放吉西他濱的化療粒子植入至胰腺組織的特定位置。觀察14d后，處死動物取出放置粒子部位的胰腺組織進行觀察。結果所有化療粒子都被成功植入，沒有粒子發生移位。胰腺組織發生局限的纖維素樣壞死區域。在病灶中心1cm的范圍內凋亡細胞數量增多。結論超聲內鏡引導下植入吉西他濱用于胰腺的組織間化療不僅安全、耐受性好，而且可使組織消融、誘導細胞凋亡。

胰腺；內鏡超聲；化學療法；吉西他濱

胰腺癌是一種惡性程度非常高的腫瘤，預后較差，5年生存率僅為5%或更低[1]，絕大多數的患者在就診時已失去手術切除的機會。對大多數手術不能切除的局部晚期胰腺癌，目前主要的治療方法有各種體內、體外放療和以吉西他濱為主的化療。由于胰腺的血供復雜，大多數胰腺腫瘤具有低血供的特點，胰腺癌全身化療效果不甚理想。為了提高實體性腫瘤內的藥物濃度，減少化療藥物的全身毒性，瘤內直接注射化療藥物的給藥方法應運而生。20世紀90年代將這種治療方法命名為組織間化療[2]，即把化療藥物和載體組成的混合物植入腫瘤內部，在體內緩慢釋放，使化療藥物在局部形成有效的治療濃度，減少全身用藥的不良反應，且在頭頸部、皮膚等惡性腫瘤的治療中取得了很好的臨床效果。由于胰腺為腹膜后器官，穿刺植入困難，內鏡超聲引導下穿刺技術具有定位準確、創傷小、穿刺距離短等優點，因此可借助內鏡超聲進行化療粒子的胰腺腫瘤內植入治療。孫思予曾在國內外最早進行了EUS引導下組織間化療的預實驗，即在EUS引導下將緩釋5-FU粒子植入豬胰腺內，觀察粒子局部胰腺組織病理學變化及生長代謝變化，證實了EUS引導下組織間化療的準確性、安全性和組織消融的有效性。經研究在生存期和臨床獲益率方面，吉西他濱均明顯優于5-Fu。能否EUS植入目前對胰腺癌療效最佳的治療藥物吉西他濱做成緩釋多聚粒子來進行組織間治療？因此，我們采用動物實驗作為預實驗，來確定內鏡超聲引導下能否將吉西他濱粒子安全地植入豬的胰腺組織中，并觀察粒子局部胰腺組織消融和細胞凋亡情況。

1 材料與方法

1.1 實驗對象：4只健康家豬，體質量40～50kg。

1.2 實驗方法：4只健康家豬，予速眠新Ⅱ肌內注射麻醉。在整個過程中，監控循環和呼吸參數。一臺帶有3.8mm通道的線陣超聲內鏡插入豬的食道中，并進入胃腔。在豬的胰腺上確定一個沒有主胰管或大的動靜脈的區域當作假定的腫瘤部位進行組織間化療。在內鏡超聲引導下經過19G穿刺針通過最接近胰腺的胃壁插入進胰腺，之后將探針取出，將化療粒子放入細針中，用探針推動細針內的化療粒子，將吉西他濱定點植入胰腺。

實驗選擇的化療粒子為合肥工業大學控釋藥物研究室所提供的，微球粒徑均＜100μm，含藥微球的含藥量為20%，藥物緩釋時間為30d。治療后，觀察動物14d，注意有無急性胰腺炎的臨床表現（如食欲不振、易怒等）。治療前抽血查血常規檢測，白蛋白、丙氨酸轉氨酶（ALT），天冬氨酸轉氨酶（AST）、血清淀粉酶作為基準水平，治療后立即抽血驗以上數值，并在組織間化療14d后再次抽血驗以上數值。在化療粒子植入14d后，將豬處死后，剖腹檢查以排除腹腔出血、胰瘺、腹膜炎等并發癥。取出胰腺組織，化療區域的變化是可見的。距植入點每間隔10mm取材一次，共5次，對組織標本冰凍保存。對組織標本進行HE染色，在光鏡下觀察組織損傷的程度，計算變性壞死區的面積。應用免疫組化技術，用原位細胞凋亡檢測（TUNEL）試劑盒，對組織標本的凋亡進行免疫組化檢測和量化分析。細胞凋亡陽性的判斷：光鏡下觀察，凋亡陽性的細胞的胞核為棕黃色或棕褐色均勻或顆粒狀染色。觀察陽性細胞的數量和分布，以40×10倍顯微鏡計數一個視野內的陽性細胞數，隨機計數5個高倍視野，求出平均每個高倍視野內陽性細胞百分率，計算凋亡指數。

2 實驗結果

4只豬都能耐受此實驗。在14d的化療觀察期，豬并沒有表現出的任何臨床癥狀及體征：腹膜出血、感染、急性胰腺炎（沒有食欲或意識，或者情緒的變化）。血液生化參數（標準偏差（SD））如下：紅細胞計數（6.56±0.14）×1012/L、白細胞計數（29.4±0.21）× 109/L、血小板計數（385.25±73.88）×109/L、白蛋白（24.68±0.41）g/L，ALT（59.25±4.5）U/L，ⅡAST（47.5±3.7）U/L，緇血清淀粉酶（758.5±18.3）U/L。手術后立即檢查酶的水平沒有變化。在第14天，實驗室調查結果：紅細胞計數（6.49±0.50）×1012/L、白細胞計數（30.05±0.39）×109/L、血小板計數（391±113.44）×109/L、白蛋白（25.65±0.80）g/L，ALT（64.75 ±3.20）U/L，ⅡAST（50.5 ±3.11）U/L，緇血清淀粉酶（778.75±17.52）U/L，生化指標的變化不顯著（P＞0.05）。將豬安樂死后取出胰腺組織，化療粒子周圍的胰腺組織呈白色（圖1），化療粒子無移位，所有粒子均可找到。病理組織學檢查證實在化療粒子周圍出現纖維素性壞死（圖2）。在壞死組織與非壞死組織之間界線清晰。壞死區域的平均直徑5.8mm（5.4～6.3mm）。在壞死區域周圍僅有輕微炎癥出現。放置化療粒子周圍20mm以外的胰腺組織以及周圍器官是正常的。在病灶中心1cm范圍的組織內出現了數量眾多的凋亡細胞（圖3），凋亡指數的平均標準差是（47.55±6.7）%。在距病灶中心5 c m 處，幾乎找不到凋亡細胞，凋亡指數的平均標準差是（0.2295±0.071）%。這2處凋亡指數的差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 植入化療粒子周圍的胰腺組織變白

圖2 在治療中心處剖開做病理，在化療粒子周圍可見纖維素性壞死

圖3 在化療中心1 cm范圍的組織內見大量凋亡細胞

3 討 論

我們用微創的方法植入化療粒子，采用組織間化療的方法，使化療藥物在局部形成高濃度，達到器官靶向治療的目的，在延長化療藥物作用時間的同時，不增加化療藥物的全身毒性[3]，望部分或完全取代全身化療，可提高晚期胰腺癌生存期和控制腫瘤相關癥狀。目前吉西他濱已成為國內外治療胰腺癌一線化療藥物，吉西他濱對局部進展期或轉移性胰腺癌具有一定療效[4-5]。間質化療能夠提高腫瘤局部的藥物濃度，從而提高腫瘤化療效果，而且毒副作用較小，尤其是可明顯降低吉西他濱的血液學毒性，同時藥物作用時間延長。

本實驗中，未見顯著的、立即的或后續出現的出血、感染、急性胰腺炎或胰管瘺等。無顯著的生物化學參數改變。結果證明與全身化療相比，組織間化療全身毒性較小。超聲內鏡引導下的組織間化療無有害輻射，即該治療對患者和操作者都是無害的。病理學檢查結果證明在化療粒子周圍出現纖維素樣壞死，在壞死組織與非壞死組織之間界線清晰。細胞凋亡指數在化療粒子植入的中心位置1 cm范圍內顯著增加。組織間化療誘導了胰腺組織的纖維素樣壞死和細胞凋亡。所有的豬多能耐受此試驗，生化水平沒有明顯變化。表明超聲內鏡引導下的豬的胰腺化療粒子植入技術是可行的，這項技術有很好的耐受性。

超聲內鏡引導下的組織間化療將被應用于緩解不能手術切除的胰腺惡性腫瘤。目前的研究還很有限，有必要對組織間化療的安全性及治療效果進行進一步的研究。針對胰腺癌的間質化療，一系列動物實驗研究都取得了很好的結果，提示間質化療在臨床上的有效應用，會成為改善晚期胰腺癌預后的有力手段。但是間質化療在胰腺癌的臨床應用研究中還處于起步階段，有許多問題需要解決。盡管把間質化療有效地應用于胰腺癌的臨床治療面臨許多難題，但是相信隨著研究的不斷深入，間質化療必將成為胰腺癌治療的手段之一。

4 結 論

組織間化療是通過手術、穿刺等方式把化療藥物和載體所形成的復合物植入腫瘤內部，利用載體在體內的緩慢降解而達到對化療藥物的緩釋作用，使化療藥物在局部形成高濃度，達到器官靶向治療的目的。超聲內鏡引導的穿刺術是目前治療胰腺疾病最精確、微創的方法。近年來，已有關于各種超聲內鏡引導下治療胰腺疾病方法的報道發表，包括超聲內鏡引導下的基因治療、射頻消融、光動力學治療、免疫學治療、胰腺內酒精注入療法、組織間近距治療。這些技術為化療粒子的植入提供了精確且安全的途徑，為胰腺腫瘤的組織間化療提供了一種新方法。超聲內鏡引導下植入吉西他濱用于胰腺的組織間化療不僅安全、耐受性好，而且可使組織消融、誘導細胞凋亡。

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[3] BREM H, EWEND M G, PIANTADOSI S, et al1 The safety of interstitial chemotherapy with BCNU2loaded polymer followed by radiation therapy in the treatment of newly diagnosed malignant gli2 omas: phase trial[J]. J N eurooncol,1995,26(2):111 2-1231.

[4] NCCN. Pancreatic adenocarcinoma V1 2009.available at http: //www.nccn.Org/professionals/physician-gls/f-guidelines. asp,03/26 /2009.

[5] Saif MW.Controversies in the adjuvant treatment of pancreatic adenocarcinoma [J].JOP,2007,8(5):545-552.

Endoscopic Ultrasound-guided Implantation of Sustained Release Gemcitabine Chemotherapy for Pancreatic Tissue Between Animal Studies

LI Yu-fei, SUN Si-yu, GE Nan, WANG Shu-peng

(Department of Gastroenterology, Red Cross Hospital of Shenyang, Shenyang 110013, China )

ObjectiveTo investigate the feasibility and safety of endoscopic ultrasonography(EUS)guided interstitial chemotherapy for the pancreas in pig’s mode1.MethodsA therapeutic 19-gauge needle was inserted into the pancreas with EUS guidance, and seeds with sustained release of gemcitabine were implanted into the tissue. After 14 days of clinical observation, the animals were sacrificed and the tissue response to local chemotherapy was examined.ResultsAll the seeds were implanted successfully and no migration was observed. Chemotherapy induced tissue fibrous necrosis was localized in the pancreas without significant complications.The apoptotic index of tissue within 1 am of the seeds increased.ConclusionImplanted gemcitabine into the pancreatic tissue with the guiding of ultrasound endoscopy is not only safety, but also tolerability, it can make the tissue ablate, induce the cell apoptosis.

Pancreas; Endoscopic ultrasonography; Chemotherapy; Gemcitabine

R445.1

B

1671-8194（2013）16-0069-03