自擬康腎口服液質量標準的建立

李獻玉

康腎口服液由人參、生黃芪、白術、茯苓、淫羊藿、紅花、金櫻子、芡實等純中藥組成的復方制劑，具有補腎健脾，化瘀通絡、固本澀精等功效，臨床用于治療慢性腎小球腎炎、腎功能不全，特別是脾腎兩虛型慢性腎炎的治療。為保證制劑的穩定性及療效，本文對其質量標準進行了研究。對方中人參、黃芪、紅花采用TCL法進行了定性鑒別，研究建立了高效液相色譜法測定羥基紅花黃色素A（HSYA）含量的方法，并制定了相應的含量測定限度。本研究最終建立了準確高、重現性好、操作簡易的質量標準方法，從而為康腎口服液的質量控制提供了可靠依據。

1 儀器與試劑

島津LC-10A型高效液相色譜儀（SPD-10Avp紫外檢測器，CTO-10Asvp柱溫箱，LC-10Atvp雙泵，N2000色譜數據工作站），色譜柱：DiamonsiLTM鉆石 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；Auto Science AS5150A 超聲波清洗器；德國 Sartorius公司BP211D（十萬分之一），BP121S（萬分之一）電子天平。

對照品：羥基紅花黃色素A（111637-200503）；對照藥材：紅花（批號120907-200709）均由中國藥品生物制品檢定所提供，乙腈為色譜純（fisher公司），水為超純水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 人參的薄層鑒別 取康腎口服液10 ml，水飽和正丁醇提取2次，20 ml/次，合并提取液，氨試液20 ml洗滌1次，蒸干正丁醇，用2 ml甲醇溶解殘渣，作為供試品溶液。另取人參皂苷Rg1、Re對照品加甲醇制成1 ml各含0.5 mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，分別吸取上述兩種溶液10 μl，分別滴于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶1∶5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，在日光下顯相同的棕褐色斑點。結果見圖1。

2.1.2 黃芪的薄層鑒別 取人參鑒別項下的供試品溶液1～10 ml容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成1 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述兩種溶液各10 μl，分別滴于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，在日光下顯相同的棕褐色斑點。結果見圖2。

圖 1 人參的薄層鑒別

圖 2 黃芪的薄層鑒別

2.1.3 紅花的薄層鑒別 取康腎口服液，作為供試品溶液。另取紅花對照藥材0.5 g，加水10 ml，超聲處理30 min、濾過，濾滾濃縮至干，殘渣加無水乙醇，攪拌，靜置，棄去無水乙醇，殘渣加水1 ml使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液0.5 μl、對照藥材溶液0.3 μl分別滴于同一硅膠 GF254薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6∶2.4∶5)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的棕色斑點。結果見圖3。

圖 3 紅花的薄層鑒別

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用試驗 色譜柱為Diamonsil C18（4.6×150 mm，5 μm），用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為乙腈-0.05%磷酸=12/88；流速為1.0 ml/min；柱溫為30℃；檢測波長為403 nm。理論板數按羥基紅花黃色素A計算應不低于3000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對照品4.00 mg于25 ml容量瓶中，加25%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成160 μg/ml的標準品母液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取康腎口服液5 ml，于50 ml容量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾即得。

2.2.4 方法學考察 陰性干擾試驗：取處方中除去紅花的其他藥材，按供試品溶液制備工藝制成陰性供試品溶液。分別吸取陰性供試品溶液、對照品溶液和供試品溶液各20 μl，注入色譜儀。結果羥基紅花黃色素A出峰時間為10 min，分離度為2.82，理論塔板數為6525，在與對照品色譜峰相應位置處無色譜峰出現，見圖4。

圖 4 羥基紅花黃色素A

線性范圍考察：精密量取 0.5、1、2、3、4、5 ml對照品母液置10 ml量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為 8、16、32、48、64、80 μg/ml的對照品溶液，精密量取各20 μl，分別注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積（X）對進樣濃度 （C，mg/ml）進行線性回歸，回歸方程為y=0.3543x-4.4449相關系數r=0.9998，結果表明，羥基紅花黃色素A濃度在8～80 μg/ml范圍內，峰面積與濃度線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液（48.00 μg/ml）20 μl，重復進樣5次。試驗結果表明：峰面積的相對標準差RSD<2%，說明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批樣品，按含量測定項下方法制備樣品，得樣品供試品溶液；取供試品溶液與對照品溶液，于0、1、2、4、8、24 h 分別進樣，進樣量 20 μl/次，記錄峰面積值。試驗結果表明，對照品及樣品供試液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批樣品6份，分別按含量測定項下方法測定，計算含量。結果表明，樣品平均含量為362.53 μg/ml，RSD<2%，所考察方法重復性良好。

加樣回收率試驗：取已知含量的樣品 （含量365.24 μg/ml）5 ml，于 50 ml容量瓶中，加 25%甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取稀釋液6份，每份5 ml置于50 ml容量瓶中，分別加入對照品溶液（48.00 μg/ml）2、2、4、4、6、6 ml，加 25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，進樣20 μl，測定，計算回收率。6次試驗的加樣回收率測定結果均在95%～105%，其平均值為99.43%，RSD為1.16%。表明本方法可靠，符合含量測定的要求。結果見表1。

表 1 回收率試驗結果

2.2.5 含量測定 按供試品溶液制備方法處理3批樣品，對其含量進行了測定，每批平行測定2次。分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液各20 μl，注入色譜儀，測定，記錄峰面積，以外標法計算含量，結果分別為362.33、362.6、365.24、365.79、370.54、368.15 μg/ml。

3 討 論

紅花的鑒別，康腎口服液中紅花為水煎煮，鑒別成分為水溶性成分，方法參考文獻[1-5]對方中紅花的薄層鑒別進行研究：最終選擇了以水為溶劑超聲處理30 min、濾過濃縮加無水乙醇，攪拌，靜置，棄去無水乙醇，殘渣加水1 ml溶解，作為對照藥材溶液。

中國藥典2005年版一部紅花藥材中有HSYA的HPLC測定方法，參照此法HSYA的峰形有較嚴重的拖尾現象，分離度也不理想，陰性樣品有干擾。本研究在參照已有文獻報道的基礎上[6，7]，考察了不同比例的甲醇—磷酸水系統、乙腈-磷酸水系統，結果發現采用乙腈-0.05%磷酸水溶液（體積比12∶88）系統洗脫，HSYA峰形對稱，與相鄰峰達到基線分離，且方法學考察也滿足實驗分析要求，所建立的HSYA含量測定方法簡便準確，重復性好，可用于紅花藥材及其復方制劑質量標準的控制。

康腎口服液3批樣品HSYA含量平均值為365.77 μg/ml，考慮到藥材的來源、炮制加工、制劑生產及貯存等因素，含量限度在3批均值的基礎上下降20%左右，故正文暫定康腎口服液HSYA含量限度為300 μg/ml。本次標準研究，測定樣品批數有限，故將含量限度暫定為HSYA不得低于300 μg/ml。

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