氣道噴霧博來霉素建立特發性肺纖維化模型的研究

王聰 朱繪明 錢衛平 韓曉冬

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種病因不明，以彌漫性肺泡炎、肺泡結構紊亂，最終肺間質纖維化為特征的疾病，發病人群主要為老年人［1］，是老年人慢性咳嗽的主要發病原因［2］。其臨床表現為進行性呼吸困難，限制性通氣障礙，最終呼吸衰竭導致死亡。目前臨床上治療效果差，治愈率低，5 年生存率只有30% ～50%［3］。為了更好地探究IPF的發病機制，需要建立與人類IPF 發展進程相似的動物模型，模擬人類IPF 發生過程中的發病特點。博萊霉素所致大鼠IPF 模型是目前公認的最接近人類病理變化的模型，許多研究中采用該模型來評價各種治療肺纖維化方法的療效。但既往的造模基本都是采用氣道滴入的方式給藥，藥物在肺內分布不均，影響實驗的重復性。本實驗采用美國PENN-CENTURY 公司生產的霧化器通過氣管插管給予實驗鼠博來霉素，建立IPF 動物模型，藥物在肺內分布更均勻，形成的纖維灶更均一。通過病理切片觀察，膠原染色、血氣分析、特異蛋白檢測等方法，探討IPF 的病理進程。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SD 雄性大鼠80 只，體質量180 ～200 g，平均(192.0 ±7.6)g，8 周齡，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供。所有操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》。

1.2 2 種方法伊文斯蘭染液分布的比較 經氣管分別采用滴入或霧化向大鼠肺內注入伊文斯蘭染液，給藥5 min 后斷頸處死大鼠，取其全肺，在PBS 中漂洗后放在濾紙上吸干表面液體，剝離肺周圍脂肪組織，觀察伊文斯蘭染液在肺組織中的分布［4］。

1.3 實驗分組 實驗動物隨機分為2 組:模型組(40只)和對照組(40 只)。模型組按5 mg/kg 氣道給予博來霉素;對照組給予生理鹽水。

1.4 主要試劑與設備 鹽酸博來霉素(天津太河制藥有限公司);MicroSprayereTM霧化器(美國PENN-CENTURY);Tissue-Tek DRSTMHE 染色系統(SAKURA 公司生產);羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);Masson 染色試劑盒(南京建成生物工程研究所);動脈采血器(BD 公司生產);i-STAT 血氣分析儀;i-STAT G3+血氣分析卡片;兔抗鼠波形蛋白(vimentin)，兔抗鼠α-SMA，兔抗鼠E-鈣黏素，(一抗均為abcam 公司生產)，HRP 標記羊抗兔IgG 抗體(南京生興生物技術有限公司)。

1.5 建造IPF 大鼠模型

1.5.1 麻醉、固定:大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(3 ml/kg)麻醉后仰面固定在60°傾斜鼠板上。

1.5.2 給藥:將光源直接照射于大鼠咽喉部皮膚表面，左手墊紗布向外向上提起舌頭，可見會厭，將霧化器的噴霧頭置于舌根與會厭的交界處，暴露聲門，將噴霧頭經聲門裂輕輕插入氣管內，立即霧化給藥博來霉素(5 mg/kg)予模型組，對照組用同樣方法給予生理鹽水。動物清醒后隨意進食。

1.5.3 標本采集:2 組分別于第7、14、21、28 天4 個時間點使用一次性動脈采血針采集腹主動脈血樣進行血氣分析;取血后斷頸處死動物，剖開胸腔，取下肺葉。

1.5.4 標本處理:取右肺下葉于4%多聚甲醛中固定24 h，連續石蠟切片，做HE 染色和Masson 染色，取右肺上葉進行羥脯氨酸含量測定，隨機取右肺中葉提取蛋白，進行Western blot 檢測。左葉肺組織放于－80 ℃冰箱待用。

1.6 統計學分析 統計數據應用SPSS 15.0 統計軟件，統計結果用(±s)表示，2 組間均數比較用t 檢驗;多組間均數比較采用單因素方差分析。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 伊文斯蘭染液在肺內的分布 伊文斯蘭能將組織染成藍色，以伊文斯蘭作為指示劑，觀察博來霉素在肺中的分布。通過觀察，經氣管滴入的伊文斯蘭在肺內分布不均，呈塊狀分布，集中在肺內個別區域，各個肺葉之間差別明顯，有的全肺葉被染成藍色，有的肺葉沒有被染色(圖1 A);經霧化的伊文斯蘭在肺內分布均勻，在肺葉中呈點狀分布(圖1 B)。

圖1 氣管內滴入(A)與氣管內霧化(B)伊文斯蘭溶液在肺組織內的分布

2.2 實驗鼠生活狀態的觀察 對照組大鼠皮毛較光亮，行動敏捷、活潑，呼吸平穩，正常飲食，體質量逐漸增加，無死亡。模型組大鼠皮毛較暗淡，在給予博來霉素的前5 d，活動較少，反應遲鈍，呼吸急促，常伴有咳嗽，在第3 天，模型組出現2 只鼠死亡，第4 天，有1 只死亡，在第5 天后模型組大鼠逐漸恢復，體質量增加，但相對于對照組增長較慢。剩余大鼠隨機在各時間點分別處死觀察。

2.3 肉眼觀察肺組織外觀形態改變 對照組大鼠雙肺未見明顯病變，呈淡紅色，表面光滑，彈性良好，未見出血點。第7 天時，肺纖維化模型大鼠肺組織明顯增大，顏色鮮紅，并見肺組織輕度充血，表面出血點增加;第14 天雙肺體積縮小，局部見大小不等結節樣改變，仍有陳舊出血點。第21 天和第28 天，模型組表現雙肺體積逐漸縮小，肺組織彈性減弱，顏色變淺，表面可見小片狀、條索狀凹凸不平的蒼白灶。

2.4 組織學的改變 HE 染色:對照組未出現病理變化，肺內組織結構清晰，肺泡間隔未見增厚，無炎癥和纖維化表現(圖2A);模型組第7 天肺泡間隔輕度增厚，炎性細胞浸潤，肺泡腔內有大量巨噬細胞和中性粒細胞，肺內結構開始紊亂(圖2B);第14 天時，肺泡炎癥有所減輕，肺泡間隔明顯增厚，開始出現纖維化(圖

2.5 羥脯氨酸含量測定 羥脯氨酸為膠原的特異組成成分，通過測定羥脯氨酸的含量可以間接反映組織2C);給藥21 d 和28 d 后纖維化現象嚴重，纖維細胞聚集形成纖維灶，彌漫分布在肺組織中(圖2D、E)。

Masson 染色:采用Masson 染色試劑盒可以將組織中的膠原特異性染為藍色。結果發現，對照組在支氣管壁上有較少的膠原，肺泡壁薄，有細小的膠原散在分布(圖3A);模型組第7 天氣管周圍和增厚的肺泡壁中開始有膠原堆積，但沒有形成片狀(圖3B);第14 天，氣管周圍膠原明顯增多，肺間質中膠原有片狀的分布(圖3C);第21 天和28 天時，肺組織中膠原含量最多，彌漫呈束狀分布在肺間質中(圖3D、E)。中膠原的沉積情況。結果發現，各時間點模型組與對照組相比羥脯氨酸含量都有所增加，第7 天模型組羥脯氨酸含量與對照組相比，差異無統計學意義(P ＞0.05)，第14、21、28 天模型組羥脯氨酸含量與對照組相比升高顯著(P ＜0.05)。對照組各時間點之間差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 IPF 動物模型組中羥脯氨酸含量的測定(±s，μg/g，n=40)

表1 IPF 動物模型組中羥脯氨酸含量的測定(±s，μg/g，n=40)

注:與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別第7 天第14 天第21 天第28天對照組680.7 ±106.4655.0 ±54.7673.3 ±45.0677.3 ±89.5模型組743.7 ±135.4789.3 ±27.6*1095.0 ±36.2＊＊934.3 ±95.9*

2.6 血氣分析 各時間點模型組與對照組相比血氧分壓都有所下降，第7、14、21 天模型組血氧分壓與對照組相比降低顯著(P ＜0.05)，第28 天模型組血氧分壓與對照組相比下降差異無統計學意義(P =0.251)。對照組各時間點之間差別無統計學意義(P ＞0.05)。見表2。

表2 IPF 動物模型組動脈血中氧分壓的測定(±s，mmHg，n=40)

表2 IPF 動物模型組動脈血中氧分壓的測定(±s，mmHg，n=40)

注:與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別第7 天第14 天第21 天第28天85.7 ±3.181.7 ±4.286.3 ±2.384.3 ±1.2模型組62.0 ±4.2＊＊63.3 ±11.4*68.7 ±7.5*對照組69.8 ±20.5

2.7 E-鈣黏素、波形蛋白、α-SMA 蛋白的Western blot 結果比較 與對照組相比，第7、14、28 天模型組肺組織中E-鈣黏素的表達量逐漸降低，成纖維細胞標記波形蛋白的表達量逐漸升高，肌成纖維細胞標記α-SMA 的表達量在第14 天和第28 天模型組中也明顯升高，提示動物模型肺纖維化逐漸嚴重。見圖4。

圖4 IPF 動物模型中E-鈣黏素、波形蛋白、α-SMA 在肺組織中的表達情況

3 討論

3.1 目前國內外學者采用多種方法建立IPF 的動物模型［5-6］，博來霉素致IPF 的動物模型雖與人類IPF 有所不同［7］，但因其病理過程與人類的纖維化過程很相似［8-9］，所以經氣管給予博來霉素是目前建立IPF 動物模型的常用方法。不同劑量的博來霉素導致大鼠的肺纖維化程度不同，本實驗室在既往研究中發現，低劑量(3.5 mg/kg)的博來霉素導致肺纖維化現象不明顯，而高劑量(8 mg/kg)導致大鼠死亡率較高，嚴重影響實驗的繼續進行，所以本實驗室目前采用較為通用的劑量(5 mg/kg)建造IPF 模型［10］。但使用傳統的氣管滴入灌注造模的方法容易造成動物窒息死亡，而且博來霉素在肺組織內分布不均勻，導致病灶不均一，不能準確地模擬人類IPF 病變的彌漫性分布，實驗結果重復性低，不能滿足實驗需要［4］。本實驗采用美國PENN-CENTURY公司生產的MicroSprayereTM霧化器，通過氣管插管實現了單次霧化給藥造模，降低了實驗鼠的死亡率，并且藥物劑量可以準確控制，藥物在肺組織內均勻分布，實驗結果重復性好，能夠滿足實驗需要。

3.2 博來霉素致大鼠的IPF 過程是隨時間而演變的，主要分為早期肺組織損傷和水腫，炎癥反應及Ⅱ型上皮細胞增生，隨后間質細胞增生，并最終發展為彌漫性的纖維化［11］。在本實驗中，肺纖維化模型組在第7 天表現為明顯的炎癥反應，肺組織中有大量的中性粒細胞浸潤;第14 天炎癥明顯減輕，并有纖維灶開始形成，膠原在氣管周圍開始累積;第21 天和第28 天，肺組織中彌漫性地分布有纖維灶和肺大泡，膠原含量明顯增多，并呈束狀分布在肺間質中。模型組羥脯氨酸含量逐漸增多，提示在模型組肺組織中膠原逐漸堆積，纖維化逐漸加重。

3.3 IPF 為肺功能限制性通氣障礙，臨床動脈血氣分析為低氧血癥。膠原的異常增生可加重低氧血癥，動脈血氣分析中氧分壓的變化是反映肺生理功能中彌散功能的指標之一。采用BD 公司生產的動脈采血器，能夠利用負壓采集到實驗鼠動脈血，且采血器內自帶適量肝素防止凝血。管體具有高致密性，采血結束立即將針頭插在絕氣橡膠栓上，能夠減少滲氣，保證采集到血樣的準確性。在本實驗中，腹主動脈血氣分析結果顯示，模型組動脈血氧分壓與對照組相比均有不同程度的降低，提示模型組的肺功能下降，肺纖維化加重。

3.4 在特定的病理條件下，肺間質內的干細胞和上皮細胞等轉化為成纖維母細胞，成纖維母細胞增殖形成成纖維細胞灶，該病灶細胞分泌膠原、纖維蛋白等大量細胞外基質，使肺泡壁增厚，肺泡結構紊亂，導致IPF形成［12］。E-鈣黏素是一種介導細胞間同質黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，主要存在于人和動物的上皮細胞中，參與形成和維護正常細胞間的連接，促進上皮細胞間相互黏附，維持組織結構的完整性和上皮極性［13］。研究表明由TGF-β 介導的上皮細胞分化(epithelialmesenchymal-transition，EMT)中，由于嚴重的間質纖維化和成纖維細胞的增殖，上皮細胞的標記物E-鈣黏素表達減少，而間質細胞和成纖維細胞標記波形蛋白表達增加［14］。E-鈣黏素表達的減少也提示細胞間黏附減弱，促進了成纖維細胞向損傷部位的遷移。由成纖維細胞轉化形成的肌成纖維細胞的標記α-SMA 逐漸增多［15］，肌成纖維細胞分泌大量膠原和其他細胞間基質，促進了肺纖維化的進程，但肺纖維化過程中更加全面的機制還有待進一步研究。在本實驗中，通過Western bolt 檢測到，肺纖維化模型組由于肺泡結構遭到破壞，上皮細胞減少，E-鈣黏素的表達逐漸下降，各種細胞間黏附作用減弱;波形蛋白表達升高，提示間質細胞和成纖維細胞逐漸增多;α-SMA 表達升高，提示肌成纖維細胞增生，肺間質中膠原和其他細胞外基質得以進一步積累，促進肺實變的發展。

綜上所述，利用美國PENN-CENTURY 公司生產的MicroSprayereTM霧化器經氣道對大鼠的肺部進行霧化給予博來霉素建立的IPF 模型，與對照組相比，肺泡結構紊亂，肺實變發生，膠原在肺間質中堆積，動脈血中氧分壓下降，肺組織中上皮細胞標記減少，成纖維細胞標記增加。這些特點與人類的IPF 的進程相似。同時，本實驗采用氣道噴霧的方法，相較于氣道滴入的常規方法，該給藥方式可使藥物在肺組織中分布更為均勻，形成的病灶更加均一。利用此方法建立的動物模型可用于IPF 的研究。

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