促黃體激素釋放激素a(LHRHa)靶向鴉膽子油脂質體的制備及質量評價

劉曉娟，常淑芳，孫江川，葉紅霞，曾飚，朱軼，朱深銀，王馳

促黃體激素釋放激素a(LHRHa)靶向鴉膽子油脂質體的制備及質量評價

劉曉娟，常淑芳，孫江川，葉紅霞，曾飚，朱軼，朱深銀，王馳

目的制備促黃體激素釋放激素a(LHRHa)靶向鴉膽子油脂質體并評價其質量。方法采用薄膜分散法結合生物素-鏈霉親和素橋接法制備LHRHa靶向鴉膽子油脂質體，正交設計優選處方，透射電鏡下觀察脂質體形態，采用Zetasizer Nano ZS分析儀測定脂質體粒徑、Zeta電位，葡聚糖凝膠柱層析結合分光光度法測定包封率，通過離心加速實驗及滲漏率考察脂質體穩定性，體外細胞實驗鑒定脂質體靶向性。結果所得優化處方為磷脂與膽固醇比4:1，藥物與脂質比3:10，DSPE-PEG-Biotin與卵磷脂質量比為3%，超聲乳化時間為8min。按此處方制備的脂質體形態圓整，粒徑為155.1±14.5nm，Zeta電位為–24.1±0.54mV，平均包封率達92.2%，對卵巢癌A2780/DDP細胞的親和力約為普通脂質體的2.7倍。結論LHRHa靶向鴉膽子油脂質體制備工藝可行，同時具有包封率高、穩定性及靶向性良好等優點。

鴉膽子油脂質體；促黃體激素；卵巢腫瘤

鴉膽子油是苦木科植物鴉膽子的干燥果實經石油醚提取所得的脂肪油[1]，是目前公認的有效抗癌中藥之一，臨床常用于肝癌、卵巢癌、胰腺癌[2]等多種腫瘤的輔助治療。隨著鴉膽子油及其制劑的廣泛應用，有關其不良反應的報道也越來越多。制備鴉膽子油靶向制劑是降低其毒性，進一步提高療效的關鍵。但目前有關鴉膽子油靶向制劑的制備尚未見文獻報道。促黃體激素釋放激素受體(LHRH-R)是近年來發現的新的卵巢癌治療靶點[3]，據報道攜帶LHRHa的靶向制劑對卵巢癌細胞具有良好的靶向性[4[4]制備LHRHa靶向鴉膽子油脂質體，以包封率為指標，采用正交實驗篩選并優化處方和制備工藝，同時對其質量及體外靶向性進行評價。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 大豆卵磷脂(lipoid S100，德國Lipoid GmbH公司)；生物素化聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-Biotin，美國Sigma公司)；生物素化LHRHa(北京中科亞光生物科技有限公司)；鏈霉親和素(streptavidin，SA，北京博奧森公司)；鴉膽子油(遼寧營口市新港藥材廠)；Sephadex G-50葡聚糖凝膠(上海浩然生物技術有限公司)；氯仿、甲醇等試劑均為分析純。NanoDrop 2000分光光度計(美國Thermo Scientific公司)；Zetasizer Nano ZS90分析儀(英國M alvern公司)；H-7500透射電鏡儀(日本HITACHI公司)；TCS-SP2型激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2LHRHa靶向鴉膽子油脂質體的制備 精密稱取大豆卵磷脂(SPC)80mg、膽固醇20mg、DSPEPEG-Biotin 240μg、鴉膽子油30mg，溶于氯仿-甲醇(5:1)的混合溶劑，真空減壓旋轉蒸干形成均勻脂質薄膜，充入氮氣，加入磷酸鹽緩沖液旋轉洗膜，水浴超聲使溶液分散形成穩定體系，依次過0.45μm、0.22μm微孔濾膜除菌，獲得生物素化脂質體混懸液。加入鏈霉親和素溶液，4℃振搖30min使其充分反應；加入生物素化LHRHa，4℃震蕩反應30m in；過Sephadex G-50柱除去游離物質，得到LHRHa靶向鴉膽子油脂質體。同時制備空白脂質體。分裝至西林瓶中，4℃冰箱避光保存備用。

1.3脂質體形態、粒徑、Zeta電位檢測 取LHRHa靶向鴉膽子油脂質體液適量，PBS稀釋后用1%磷鎢酸溶液負染，滴至銅網上晾干，在透射電鏡下觀察脂質體形態、粒徑并攝制照片。用Zetasizer Nano ZS分析儀測定脂質體Zeta電位。

1.4正交實驗設計與處方優化 在單因素實驗基礎上，采用正交實驗優化LHRHa靶向鴉膽子油脂質體的處方和制備工藝，以包封率作為考察指標。影響LHRHa靶向鴉膽子油脂質體粒徑大小與包封率的主要因素包括卵磷脂與膽固醇質量比(A)、藥物與脂質的質量比(B)、DSPE-PEG-Biotin與卵磷脂質量比(C)、超聲乳化時間(D)。上述4種因素各取3個水平，采用正交設計L9(34)對處方進行優化(表1)。

1.5質量控制

1.5.1線性關系 用紫外分光光度儀測得鴉膽子油溶液最大吸收波長為234nm，故選擇234nm為測定波長。取鴉膽子油標準品適量，用甲醇配成濃度為0.89、1.78、2.67、3.56、4.45mg/m l系列標準液，在234nm處測定以上各溶液的吸光度(A)值。以A值對濃度(c)進行線性回歸，回歸方程為A=0.127c+0.007(r=0.9995，n=5)。結果表明，溶液在0～4.45mg/m l范圍內線性關系良好。

表1 正交實驗因素-水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5.2精密度實驗 分別取低、中、高3個濃度的鴉膽子油標準液，在1d內不同時間重復測定5次，計算日內精密度。另每日測定1次，連續測定5d，計算日間精密度。

1.5.3柱回收率 分別移取鴉膽子油標準液0.1、0.3、0.5m l進行柱層析，收集游離藥物組分后稀釋定容，于234nm處測定A值，代入標準曲線計算柱回收率。

1.5.4洗脫曲線 取LHRHa靶向鴉膽子油脂質體混懸液上柱(經水溶脹的葡聚糖凝膠柱)，以PBS為洗脫液，分離脂質體和游離藥物。收集脂質體流份用10% Tritonx-100溶液破乳后稀釋，于234nm處測定A值。洗脫曲線如圖1所示，最先流出的1～8m l為脂質體混懸液，12～16m l為游離物質溶液。

Fig.1 Elution curve of LHRHa-targeted Bruceajavanica oil liposome

1.5.5包封率測定 精密移取LHRHa靶向鴉膽油脂質體液0.5m l上柱，以PBS洗脫，收集1～8m l流份共8m l，混合均勻，用10% Tritonx-100溶液膜稀釋后測定A值，由標準曲線計算脂質體中包封藥量。按2005年版《中國藥典》規定[5]，計算包封率。包封率=(W總－W游)/W總×100%。W總為總藥量，W包為包入脂質中的藥量，W游為未包入脂質體的藥量。

1.6穩定性考察

1.6.1離心加速實驗 將按最優處方制備的LHRHa靶向鴉膽子油脂質體進行離心加速實驗(4℃，1000r/m in，離心5m in)。用分光光度計測定脂質體離心前后234nm處A值的變化，求穩定性參數KE。，其中A0為脂質體離心前的A值，A為脂質體離心后的A值。

1.6.2脂質體在不同貯存條件下的穩定性 將LHRHa靶向鴉膽子油脂質體分裝至西林瓶于4℃、25℃條件下密閉避光保存，間隔一定時間取樣考察外觀、滲漏率。按1.5.5中的方法測定不同時間包封率，并計算滲漏率。滲漏率=(W包－W儲)/W包×100%，其中W包、W儲分別為制備時的包封率和貯存一定時間后的包封率。

1.7體外靶向性鑒定 以香豆素-6(一種綠色熒光物質)為模型藥物，按1.2方法分別制備包載香豆素-6的普通脂質體(A)和LHRHa靶向脂質體(B)。取培養好的卵巢癌A2780/DDP細胞(表達LHRH受體)，分別加入上述兩種脂質體，2h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞熒光強度。

2 結 果

2.1脂質體形態、粒徑、Zeta電位 鏡下見脂質體外觀圓整，粒徑分布均勻(圖2)。制得的脂質體經多次濾膜過濾后粒徑為155.1±14.5nm，多分散系數(PDI)為0.227，符合正態分布規律。Zetasizer Nano ZS分析儀測定結果顯示脂質體荷負電，為–24.1±0.54mV。

圖2 LHRHa靶向鴉膽子油脂質體透射電鏡照片(×25 000)Fig.2 Transm ission electron m icroscopic photograph of LHRHa-targetedBruceajavanicaoil liposome (×25 000)

2.2正交實驗結果 對表2結果進行直觀分析，由極差R可知對包封率(EE%)的影響由高到低依次為B＞A＞C＞D。在實驗所選范圍內，藥物與脂質的質量比是主要影響因素，最佳處方工藝組合為B3A3C2D3，即選擇卵磷脂與膽固醇之比為4:1，藥物與脂質比為3:10，DSPE-PEG-Biotin質量為卵磷脂的3%，超聲乳化時間為8min。

表2 L9(34)正交實驗結果Tab.2 Results of L9(34)orthogonal design

表3 LHRHa靶向鴉膽子油脂質體離心加速實驗結果(n=3)Tab.3 Centrifugal acceleration experiment results of LHRHatargetedBruceajavanicaoil liposomes (n=3)

表4 LHRHa靶向鴉膽子油脂質體不同時間滲漏率(%)Tab.4 Percolation rates at different times of LHRHa-targetedBruceajavanicaoil liposomes

2.3結果驗證 按2.2項中所得處方B3A3C2D 3制備LHRH a靶向鴉膽子油脂質體3批，包封率分別為90.4%、92.6%、93.5%，平均包封率為92.2%±1.59%，表明按該處方制備的脂質體包封率高，且重現性良好。

2.4精密度及柱回收率 計算日內、日間精密度，其RSD均小于2%，表明精密度良好。平均柱回收率為98.62%，RSD為1.80%，符合實驗要求。

2.5初步穩定性考察 表3中數據表明，穩定性參數KE變化較小，脂質體穩定性良好。考察脂質體在不同貯存條件下的穩定性，結果顯示4℃條件下脂質體混懸液放置15d為淺白色，無分層、沉淀現象，25℃放置1周即出現大量絮狀沉淀，外觀渾濁，如表4中數據所示，說明靶向脂質體在4℃條件下保存可提高其穩定性。

2.6體外靶向性實驗結果 激光共聚焦顯微鏡觀察(圖3)可見，A組細胞內僅有微弱熒光，熒光值為38.5±3.8，而B組細胞內出現明亮的綠色熒光，熒光值為103.8±6.4，約為A組的2.7倍，表明LHRHa靶向脂質體對表達LHRH受體的卵巢癌細胞具有較強的靶向親和能力。

圖3 卵巢癌A2780/DDP細胞對香豆素-6脂質體(A)及LHRHa靶向脂質體(B)的攝取情況Fig.3 Intake of coumarin-6 liposomes (A) and LHRHatargeted liposomes (B) by ovarian cancer A2780/DDP cells

3 討 論

卵巢癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，早期診斷困難，且晚期患者5年生存率較低[6]。腫瘤細胞減滅術輔以化療是治療卵巢癌的重要手段，但傳統的化療藥物缺乏靶向性，在殺傷腫瘤細胞的同時易對機體正常組織造成損害，產生不良反應。因此，靶向藥物的研發成為卵巢癌化療的熱點問題。鴉膽子油為脂溶性藥物，易包裹入脂質體微粒，且研究發現其在殺死腫瘤細胞的同時可提高機體的免疫功能，并逆轉腫瘤對傳統化療藥物的耐藥性[7]。近年來文獻報道，LHRHa靶向抗腫瘤藥物及其脂質微泡對卵巢癌細胞具有良好的靶向性[4,8]。本實驗采用薄膜分散法及生物素-鏈霉親和素橋接法制備LHRHa靶向鴉膽子油脂質體，將我國傳統中藥與脂質體結合制備成主動靶向制劑，以期為卵巢癌靶向藥物治療提供新的方向。

本研究采用正交設計優化處方，結果發現，在卵磷脂與膽固醇之比為4:1，藥物與脂質比為3:10，DSPE-PEG-Biotin質量為卵磷脂的3%，超聲乳化時間為8m in條件下鴉膽子油的平均包封率達到92.2%，且重現性好，后續實驗即按該處方比進行。經透射電鏡觀察，該靶向脂質體為球形，粒徑為155.1±14.5nm，脂質體表面帶負電，Zeta電位為–24.1±0.54mV，均符合實驗要求。

脂質體穩定性是反映脂質體質量的主要指標。本研究結果顯示，離心加速前后該脂質體在234nm處的吸光度值沒有明顯變化，其穩定性參數KE變化較小，提示該靶向脂質體可耐受離心加速過程。貯存溫度及時間也是影響脂質體穩定性的重要條件，本研究在4℃、25℃條件下連續觀察該脂質體的外觀形態及滲漏率，結果發現：4℃條件下脂質體混懸液放置15d內為淺白色，無分層、沉淀現象；25℃放置1周即出現大量絮狀沉淀，外觀渾濁，隨著放置時間延長而明顯。在4℃貯存條件下，脂質體滲漏率低，但在25℃貯存條件下滲漏率明顯增加，提示該靶向脂質體在4℃條件下保存可提高穩定性。

脂質體的靶向性是決定其能否用于靶向治療的關鍵。本研究將包載香豆素-6的普通脂質體及LHRHa靶向脂質體與卵巢癌A2780/DDP細胞分別共同培養2h，激光共聚焦顯微鏡下觀察發現LHRHa靶向脂質體組細胞內熒光強度是普通脂質體組的2.7倍，提示卵巢癌細胞對LHRHa靶向脂質體的攝取能力明顯增加，該脂質體具有體外尋靶功能。本研究為鴉膽子油脂質體用于卵巢癌的靶向治療提供了實驗依據。

[1] Yu YL, Lu Y, Tang T,etal. Form ulation, p reparation and evaluation of an intravenous emulsion containingBruceajavanicaoil and coix seed oil for anti-tumor application[J]. Biol Pharm Bull, 2008, 31(4): 673-680.

[2] Lau ST, Lin ZX, Zhao M,etal.Bruceajavanicafruit induces cytotoxicity and apoptosis in pancreatic adenocarcinoma cell lines[J]. Phytother Res, 2008, 22(4): 477-486.

[3] Ko SY, Guo H, Barengo N,etal. Inhibiton of ovarian cancer grow th by a tum or-targeting pep tide that binds eukaryotic translation initiation factor 4E[J]. C lin Cancer Res, 2009, 15(13): 4336-4347.

[4] Guo J, Chang SF, Sun JC,etal. Preparation andinvitrotargeting experiment of LHRHa targeted m icrobubble contrast agent[J]. Chin J Med Imaging Technol, 2011, 27(3): 466-469. [郭娟, 常淑芳, 孫江川, 等. LHRHa靶向微泡造影劑的制備及體外尋靶實驗[J]. 中國醫學影像技術, 2011, 27(3): 466-469.]

[5] The State Pharmacopoeia Comm ittee. Chinese Pharmacopoeia (Part Ⅱ)[M]. Beijing: Chem ical Industry Press, 2005. 181. [國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(二部)[M]. 北京: 化學工業出版社, 2005, 181.]

[6] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2012, 62(1): 10-29.

[7] Chen D, Chen P, Zhu M,etal. Reversal effect ofBruceajavanicaoil emulsion on drug-resistant human ovarian cancer cell A2780/ DDP[J]. Chin Emerg Med, 2009, 18(4): 598-599. [陳丹, 陳萍,祝敏, 等. 鴉膽子油乳對人卵巢癌耐藥細胞A2780/DDP的耐藥逆轉作用[J]. 中國中醫急癥, 2009, 18(4): 598-599.]

[8] Chang S, Guo J, Sun J,etal. Targeted m icrobubb les fo r ultrasound mediated gene transfection and apoptosis induction in ovarian cancer cells[J]. U ltrason Sonochem, 2013, 20(1): 171-179.

Preparation and quality evaluation of LHRHa-targeted Brucea javanica oil liposomes

LIU Xiao-juan1, CHANG Shu-fang1, SUN Jiang-chuan1, YE Hong-xia1, ZENG Biao1*, ZHU Yi1, ZHU Shen-yin2, WANG Chi3
1Department of Gynaecology and Obstetrics, Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China
2Department of Pharmacy, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
3College of Pharmacy, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
*

, E-mail: cqzb1018@yahoo.com.cn
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (30801228), the Key Item of Chongqing HealthBureau (2010-1-39), and the Key Project of Chongqing Traditional Chinese Medicine (2010-1-6)

ObjectiveTo prepare luteinizing hormone-releasing hormone a (LHRHa) targetedBruceajavanicaliposomes and evaluate its quality.MethodsThe LHRHa-targetedBruceajavanicaliposome was prepared by thin layer dispersion together with biotinstreptavidin bridge method. The optimum formation was selected by means of orthogonal design of experiment. The morphology of liposome was observed with transmission electron microscope. Zetasizer Nano ZS analyzer was used to measure the particle size and zeta potential. The entrapment efficiency was determ ined by ultra-violet spectroscopy and column chromatography. Centrifugal acceleration experiment and determ ination of leak rate were performed to prove the liposome stability. The targeting ability of liposome was appraised by cell experimentinvitro.ResultsThe formed optimum formula was as follows: the ratio of lecithin to cholesterol was 4:1,Bruceajavanicaoil:lipid was 3:10, DSPE-PEG (2000)-Biotin:lecithin content was 3%, ultrasonic-homogenized for 8 minutes. Liposomes were round in shape, the average diameter and zeta potential of liposome were 155.1±14.5mm and –(24.1±0.54) mV, respectively. The average entrapment efficiency was 92.2%. Binding capacity with the A2780/DDP cell line in the LHRHa-targeted liposomes was 2.7 times higher than that in the non-targeting liposomes.ConclusionThe technique of preparing LHRHa-targetedBruceajavanicaliposome is suitable, and high in entrapment efficiency, with good stability and targeting ability.

Bruceajavanicaliposomes; luteinizing hormone; ovarian neoplasms

R943

A

0577-7402(2013)07-0548-04

2013-02-11；

2013-04-22)

(責任編輯：李恩江)

國家自然科學基金(30801228)；重慶市衛生局重點項目(2010-1-39)；重慶市中醫處重點項目(2010-1-6)

劉曉娟，醫學碩士。主要從事腫瘤藥物的靶向治療研究

400010 重慶 重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科(劉曉娟、常淑芳、孫江川、葉紅霞、曾飚、朱軼)；400016重慶 重慶醫科大學附屬第一醫院藥劑科(朱深銀)；400016重慶 重慶醫科大學藥學院(王馳)

曾飚，E-mail：cqzb1018@yahoo.com.cn