淺析反相HPLC色譜柱的清潔和再生

李雪慧 丁現帥

(陜西漢江藥業集團股份有限公司，陜西 漢中 723000)

高效液相色譜法具有分離效能高、檢測靈敏度高、分析速度快、選擇性高等諸多優勢，使其在分析領域中的到廣泛的應用。反相色譜因其可分析極大多數的非極性物質和很多的可離子化的及離子化合物而成為高效液相色譜中應用最廣泛的技術。而反相色譜柱作為反相色譜分析的不可或缺的部分，它的日常維護、清洗與再生就顯得尤為重要。

在反相HPLC分析時，被分析樣品的基體往往會包含多種化合物，如鹽、脂質、含脂物質、腐質酸、疏水蛋白質和其它一些生物物質，這些可能在使用時與HPLC柱發生相互作用。一般情況下這些物質有比分析者的目標物或少或大的保留值。那些保留值較小的物質如鹽類一般來說在空體積時就被沖出色譜柱。這些非目標產物的干擾能被檢測器檢測到而且能形成色譜峰，氣泡，基線上移或者是負峰。如果樣品成分在柱子中有很強的滯留，多次進樣后，這些吸附在柱子表面的物質通常就會積累在柱頭。有著中等保留值的樣品可被慢慢洗脫，通常表現為寬峰，基線擾動，或者基線漂移。

有時候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度時，就會覆蓋部分鍵合固定相表面，形成一種新的固定相。分析物能與這些雜質作用形成一定的分離機理，保留時間會發生漂移并產生拖尾峰。當柱子被污染，它的色譜行為和沒被污染的柱子會有所不同。如果色譜柱被嚴重污染，柱子的反壓超過泵所能承受的最大壓力，而使分析工作無法進行。被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復原來的操作條件。

再生被污染HPLC色譜柱的關鍵是知道污染物的性質并且能找到適當的溶劑來去除。如果流動相pH值過大，則會破壞溶解硅膠而導致鍵合相流失，使得色譜柱無法恢復。

當用二元混合溶劑進行等度洗脫時，可用20個柱體積的90～100%的強洗脫溶劑沖洗清除污染物，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。如果使用的是緩沖液系統，應該先用高純水沖洗5～10個柱體積后更換成強溶劑，以防HPLC流動體系中的緩沖液沉淀，導致泵泄漏、管道堵塞及柱頭堵塞等。值得注意的是，在沖洗色譜柱時，應將色譜柱從系統上取下，反向連接到輸液泵上，色譜柱出口不要連接到檢測器上，以免污染檢測器流動池。

有時候，強溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強的溶劑或者是一系列溶劑就有必要用來清洗柱子了，如果污染物是非生物物質，可以跳過一個或多個另外的有機溶劑去除污染物。對于硅膠鍵合柱來說(如果沒有緩沖液的系統)，一般清洗順序是：

用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相溶性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用水相溶劑，每種溶劑至少沖洗10個柱體積，可以用1～2ml/min的流速來沖洗，要恢復原來的溶劑體系，不需要每一步都沖洗，可以跳過中間步驟。

四氫呋喃對很多物質有很好的溶解性，因此是一種很好的清洗溶劑。如果柱子被嚴重污染，可以二甲基亞砜(DMSO)或者二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合，用低于0.5ml/min的流速沖洗色譜柱。

對于C18鍵合柱，為去除色譜柱中含有的緩沖鹽溶液或水溶性物質時，應使用含5%的有機溶劑的水溶液進行沖洗。應避免單獨使用水進行沖洗，以免損傷色譜柱。

反相HPLC色譜柱的再生除用以上溶劑進行清洗外，還可以根據具體情況用以下方法進行再生：

(1)如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10%的稀硝酸內超聲清洗10分鐘，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱。

(2)如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細修復后，重新安裝上柱頭螺絲。

總之，成功再生反相柱子是一個非常耗時間的過程，在進行分析時，盡可能的做好樣品純化，并在分析工作結束后，及時清洗色譜柱，即使是長期不用的色譜柱也要進行定期清洗維護，以免使色譜柱污染嚴重而無法使用。

［1］高效液相色譜方法及應用，于世林，化學工業出版社，2004

［2］高效液相色譜儀的管理與維護，張燕婉，汪劭婷