血紅蛋白在膜修飾電極的電還原機制分析

謝 英 冉 升

(1.保定學院生化系，河北 保定 071000;2.保定市第二中學，河北 保定 071000)

血紅蛋白(Hb)是人體中一類重要的生物大分子，其具有運氧功能。定量測定血清中Hb是疾病檢測、生化分析的重要指標，電化學方法在生物化學分析方面應用廣泛，然而Hb在未修飾電極上過電位很大，很難發生還原反應，檢測不到電流信號。文獻表明可以加入修飾媒介體[1]或加入促進劑[2]。本文研究Hb在月桂酸、膽固醇和大豆卵磷脂修飾的玻碳電極上的電化學行為，運用循環伏安方法、數值分析和計算機模擬為基本的研究手段，以期得到合理的理論模型，繼而有效地控制Hb的電還原過程。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器:電化學工作站(美國普林斯頓公司)，工作(月桂酸、大豆卵磷脂和膽固醇修飾的玻碳電極)、輔助(大面積的鉑片電極)、參比電極(Ag/AgC1電極)組成的三電極體系。

試劑:牛血紅蛋白，月桂酸，大豆卵磷脂，膽固醇、氯化鉀，氯仿等。0.02mol/L磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉(pH=5～8)為緩沖溶液.所用試劑均為分析純。

1.2 實驗設計

以血紅蛋白在磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉緩沖溶液中，玻碳電極依次經丙酮、稀硫酸(1.00mol/L)、去離子水超聲洗滌。用Al2O3粉末拋光，再用去離子水清洗電極，最后用濾紙將電極表面吸干。將已拋光的玻碳電極倒立且固定在干燥的燒杯內，用微量注射器取成膜液(月桂酸、大豆卵磷脂、膽固醇)5μL均勻滴加在電極表面，蓋好玻璃罩待溶劑揮發后測定血紅蛋白濃度，溶液PH，電勢掃描速率等對峰電流的影響。

2 結果與討論

2.1 循環伏安圖譜的直觀信息

2.1.1 不同電勢掃描速率下的循環伏安響應譜

由圖可知，無陽極氧化峰出現，陰極呈現出單一的還原峰，且電勢掃描速率越高該還原峰電勢越小，故可認為血紅蛋白在該膜修飾的電極電催化還原反應為不可逆。

2.1.2 連續多次循環伏安掃描測試

連續多次伏安掃描測試中，血紅蛋白還原峰電流先增加后減小，因而可認為血紅蛋白在該膜修飾電極的電催化還原反應有弱吸附現象。

(圖1 不同掃描速率下的循環伏安曲線，血紅蛋白濃度:1.01 ×10-6 mol/L，pH=5.00。響應曲線1—6所對應的電掃描速率分別為，10、20、40、60、80 和100mV/s)

2.2 信息數據的解析與擬合

2.2.1 血紅蛋白的[ip，V]PH，c數據集的線性回歸處理

分別對

ipa=ka×v (2)線性回歸擬合，

(表1 不同溶液pH條件下ip對，ip對V的回歸處理血紅蛋白濃度:1.00 ×10-6Mol/L;電勢掃描速率 ν 在10 ～100mV/s.)

(表1 不同溶液pH條件下ip對，ip對V的回歸處理血紅蛋白濃度:1.00 ×10-6Mol/L;電勢掃描速率 ν 在10 ～100mV/s.)

溶液PH ip=k0+kd×v 1 2 ip=k0+ka ×v k0×106 kd×105 R F×103 K0×106 kd×104 R F×103 8.0 -2.17 3.59 0.985 25.7 1.03 0.867 0.998 1.63 7.5 -2.03 4.51 0.996 3.91 2.11 1.07 0.990 14.4 7.0 -5.29 6.37 0.995 31.9 0.517 1.52 0.994 19.7 6.5 -4.54 5.73 0.993 34.8 0.662 1.37 0.995 8.37 6.0 -6.38 7.46 0.986 75.7 0.294 1.80 0.999 2.19 5.5 -3.55 5.27 0.996 12.2 1.26 1.26 0.996 9.83 5.0 -3.12 4.82 0.998 7.24 1.29 1.15 0.995 13.6

模型擬合，見表1(F為誤差平方和)，線性相關系數R≥0.917，但其回歸直線截距k0不為零(與峰電流相比太大)，ip～的數值都隨電勢掃描速率增大而變大，ip～V的數值都隨電勢掃描速率增大而減小，不能視為常數【3】，故不能確定是吸附還是擴散控制。

2.2.2 血紅蛋白的[ip，V]PHρ二元線性回歸處理

對涉及電活性質粒吸附反應體系來說，

(表2 不同溶液PH條件下ip對kd+kav二元線性回歸處理血紅蛋白濃度:1.00×10-6 Mol/L，電勢掃描速率ν在10～100mV/s。)

(表2 不同溶液PH條件下ip對kd+kav二元線性回歸處理血紅蛋白濃度:1.00×10-6 Mol/L，電勢掃描速率ν在10～100mV/s。)

溶液PH kd×106 ka×105 F×102 8.0 10.4 6.32 6.82 7.5 23.5 5.05 4.52 7.0 7.08 13.3 20.1 6.5 7.92 11.7 6.00 6.0 2.54 17.5 3.74 5.5 14.3 9.09 3.86 5.0 14.8 7.85 5.36

采按照ip=ipd+ipa=kd×+ka×v模型進行回歸處理結果F(誤差平方和)值明顯增大。

綜上，對ipd=kd×，ipa=ka× v，ip=ipd+ipa=kd×+ka×v所得出數據并不理想，即該擴散和吸附行為與電化學理論中常規模型并不相同。

2.2.3 血紅蛋白的[ip，C]PH，v數據集的回歸處理

(圖2 血紅蛋白的濃度C與還原峰電流ip的關系(ν=20mv/s，pH=6.0)

圖2中 ip～C 曲線類似 Michaelis-Menton【4】方程，可表示為，考慮到吸附態活性物質對電流有顯著影響，對(4)式進行修正得

表3 以(4)(5)式為模型的非線性回歸處理ν=20mv/s，pH=6.0

表3可見，F值更大些，且K0參數大于[ip，C]PH，v數據集中最小濃度對應的ip值(2.17×10-7A)。故對(4)和(5)式施以分形修正，給出如下模型

表4 以(6)(7)式為模型的非線性回歸處理ν=20mv/s，pH=6.0

由于 α =2-D=1.34，因而求出分維 D=0.66。

3 結論

經月桂酸、大豆卵磷脂和膽固醇修飾的玻碳電極的微孔粗糙程度不一，且血紅蛋白微粒表面凹凸不平，而電催化反應一般是在一系列孤立的點上進行，即該電極/溶液界面結構類似于Cantor集合，Hausdorff維數 D=0.66，處于0和1之間Hausdorff維數(D=0.66)偏離1的程度較大，故可推斷血紅蛋白在經月桂酸、大豆卵磷脂和膽固醇修飾的玻碳電極上的電催化還原機制比較復雜[5]，可進一步研究討論。

[1]袁倬斌，張玉忠，趙紅。分析化學，2001，29：1332-1335

[2]何亞楠，李根喜，史海蓉等。分析化學，1997，25(1)：49-51

[3](美)A.J.巴德，L.R.福克納著，谷林锳等譯。《電化學方法原理及應用》，化學工業出版社，1984，616-620

[4]李后強，趙華明。自然雜志，1999，13(6)327-330

[5]丁小勤，胡勁波，李啟隆。蛋白質的電分析化學研究[J]，分析試驗室，2006 年01 期