耐碳青霉烯銅綠假單胞菌耐藥機制和傳播機制研究＊

鄭 芬，芮勇宇（南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院檢驗醫(yī)學科，廣州 510515）

隨著抗生素的大量使用，臨床耐碳青霉烯銅綠假單胞菌日漸增多，給臨床抗感染治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)［1］。銅綠假單胞菌耐藥機制復雜，本研究主要探討碳青霉烯酶、可移動耐藥元件整合子Ⅰ和插入序列共同區(qū)（ISCR1）與耐藥性的關系，并采用腸桿菌科間重復一致性序列（ERIC）－聚合酶鏈反應（PCR）對臨床分離的59株耐碳青霉烯銅綠假單胞菌進行同源性和傳播機制研究，報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及鑒定 收集南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院2011年1～12月臨床分離的碳青霉烯耐藥的銅綠假單胞菌（排除重復菌株）共59株，其中25株來自于呼吸科、18株來自于外科重癥監(jiān)護病房、16株來自于神經內科，這些菌株均分離于下呼吸道感染患者的痰液。所有分離的菌株采用BD Phoenix100儀器進行鑒定和藥敏試驗，頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素藥敏試驗采用K－B法，藥敏紙片購自英國Oxoid公司。用 WHONET5.6分析菌株藥敏情況。質控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）。

1.2 儀器與試劑 德國Eppendorf公司的PCR擴增儀，Bio－Rad公司的凝膠成像儀。TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K、Hinf I均為TaKaRa公司產品。Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、10%十二烷基磺酸鈉（SDS）購自北京鼎國生物技術有限公司。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 細菌DNA模板制備 將菌株接種5mL LB肉湯，35℃培養(yǎng)18h。取菌液1 000μL，12 000r/min離心5min，細胞沉淀物以無菌磷酸鹽緩沖液洗滌，SDS－蛋白酶K裂解后，利用酚－氯仿進行抽提，乙醇洗滌后用TE緩沖液（10mmol/L Tris，1mmol/L乙二胺四乙酸）溶解DNA沉淀，于－20℃保存。

1.4 Ⅰ類整合子結構研究 先采用PCR對59株銅綠假單胞菌進行整合酶I基因擴增，陽性菌株進一步對其可變區(qū)即整合子Ⅰ進行PCR擴增。所用引物和反應體系均參照文獻［2］。可變區(qū)陽性的PCR產物進行限制性核酸片段長度多態(tài)性分析（RFLP），所用反應體系均為20μL，含10×H Buffer 2μL，Hinf I 5U，5μL陽性PCR產物模板，加入滅菌去離子水至20 μL。37℃酶切消化1h后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并挑選不同譜型的PCR產物送深圳華大基因公司測序。

1.5 ISCR1結構研究 先采用PCR對59株菌進行ISCR1基因擴增，陽性菌株進一步擴增ISCR1可變區(qū)基因，所用引物均參照文獻［3］。

1.6 復雜性整合子結構研究 對于整合子Ⅰ和ISCR1可變區(qū)均陽性的菌株，先針對整合子Ⅰ的3′保守區(qū)和ISCR1的5′保守區(qū)設計共同區(qū)引物，引物1為5′－GTA TTG CGC CGC TCT TAG AC－3′，引物2為5′－AAA CCA GCA TGG TTG GCT AC－3′。若擴增陽性，再針對整合子Ⅰ和ISCR1可變區(qū)設計引物，引物3為5′－TCC CGA GGT CAC CAA GAT－3′，引物4為5′－TTA CTC CCA AGG GTT CCA G－3′，擴增從整合子Ⅰ可變區(qū)到ISCR1可變區(qū)之間的片段。

1.7 常見碳青霉烯酶基因檢測 PCR檢測碳青霉烯酶基因KPC、NDM、IMP、VIM和SPM。所用引物均參照文獻［1，4］，各基因的陽性對照株均為本課題組PCR檢測后經測序驗證過的臨床分離株。各基因陽性的PCR產物送深圳華大基因測序驗證。

1.8 ERIC－PCR基因分型 ERIC－PCR引物序列 ERIC－2：AAG TAA GTA ACT GGG GTG AGC G，反應條件為95℃預變性5min；94℃變性1min，26℃退火2min，72℃延伸1 min，4個循環(huán)；94℃變性1min，40℃退火1min，72℃延伸1 min，40個循環(huán)；72℃延伸10min。

2 結 果

2.1 I類整合子結構 59株碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌中，20株（34%）整合酶Ⅰ陽性，17株（29%）整合子Ⅰ可變區(qū)擴增陽性，RFLP分型顯示，50株整合子Ⅰ陽性菌株共分為3個譜型分別測序。測序比對結果顯示，7株為A類型，攜帶氨基糖苷類耐藥（aacA4）；6株為B類型，攜帶氨基糖苷類耐藥（aadA7）；4株為C類型，攜帶氯霉素類和氨基糖苷類耐藥（catB3＋aacA4）基因盒。

2.2 ISCR1結構 59株碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌中，9株（15%）ISCR1陽性，5株（8%）檢測到可變區(qū)陽性。RFLP分型顯示，5株為同一譜型，測序結果表明可變區(qū)攜帶基因盒喹諾酮耐藥（qnrA1）和β－內酰胺類耐藥（ampR）。

2.3 復雜性整合子結構 復雜性整合子驗證結果顯示，1株整合子Ⅰ和ISCR1可變區(qū)均陽性的菌株共同區(qū)擴增陽性，進一步針對整合子Ⅰ和ISCR1可變區(qū)設計引物進行擴增也為陽性，提示這株菌均攜帶一種復雜性Ⅰ類整合子，基因盒排列為catB3＋aacA4＋ISCR1＋qnrA1＋ampR。

2.4 常見碳青霉烯酶基因 59株碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌中3株檢出VIM－2基因，2株檢出IMP－1基因，未檢出其他碳青霉烯酶基因。

2.5 ERIC－PCR基因分型結果 59株菌株ERIC－PCR圖譜顯示電泳條帶集中分布在200～5 000bp，每株菌株都擴出至少4個條帶。采用Quanlity One軟件進行聚類分析，相似性聚類分析結果表明，59株菌株在80%的相似水平上被聚為52個類群。

3 討 論

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的重要條件致病菌，隨著能夠水解碳青霉烯類抗菌藥物金屬β－內酰胺酶的產生，對碳青霉烯類抗菌藥物及第3代頭孢菌素耐藥銅綠假單胞菌的分離率日漸增多，給臨床抗感染治療帶來極大的困難［5］。對碳青霉烯類耐藥主要與其產生β－內酰胺酶（如金屬酶）有關，而且這些耐藥基因常位于整合子和ISCR等耐藥元件的可變區(qū)基因盒中。整合子是一種運動性的DNA分子，具有捕獲外源游離基因片段的功能，是細菌遺傳和變異的天然克隆和表達系統(tǒng)，臨床以I類常見［6］。ISCR1也是一種強大的耐藥基因捕獲元件，屬于IS1－like家族，通過滾環(huán)復制的方式轉作鄰近的耐藥基因，常位于普通整合子Ⅰ的3′末端［7］。

本院分離的59株碳青霉烯銅綠假單胞菌均為多重耐藥，研究發(fā)現(xiàn)整合子Ⅰ主要攜帶aacA4、aadA7和catB3，ISCR1主要攜帶qnrA1和ampR，復雜性整合子更是同時攜帶aacA4、catB3、qnrA1和ampR，提示整合子Ⅰ和ISCR1在銅綠假單胞菌介導多重耐藥方面有重要作用。59株菌株中5株攜帶金屬酶基因，攜帶率為8%，表明除了金屬酶的水解作用可以使銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物產生抵抗之外，還有其他機制參與，如膜孔蛋白的缺失、外排泵的過度表達等［8］；同時也提示本院銅綠假單胞菌已有金屬酶產生，這和碳青霉烯類抗菌藥物在本院廣泛應用密切相關，應引起臨床和控制感染部門的高度關注，應杜絕不合理使用碳青霉烯類抗菌藥物的現(xiàn)象。

銅綠假單胞菌是醫(yī)院內感染的重要致病菌，醫(yī)院內感染的原因主要是：（1）外源性交叉感染；（2）受自身免疫功能低下所致的內源性感染。ERIC－PCR操作簡單、分型效率高、價格低廉，非常適合于研究醫(yī)院內感染傳播機制［9］。本院臨床分離的59株菌株均能擴增出條帶，分辨率高，圖譜聚類分析顯示80%的相似水平上被聚為52個類群，基因型分散，未顯示親密的親緣關系，不存在克隆傳播現(xiàn)象，由此表明59例耐碳青霉烯銅綠假單胞菌感染患者均為散發(fā)，不存在暴發(fā)或流行。

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