知母多酚對血管內皮的保護作用

劉翠華

隆回縣人民醫院藥劑科 422200

知母為百合科植物知母(Anemarrhena asphode-loides Bunge)干燥的根莖，《神農本草經》中記載百合性苦寒，具有滋陰降火、潤腸滑燥、除煩止渴、利小便的作用。現代藥理研究發現，知母中主要含有甾體皂苷、雙苯吡酮類，另有木脂素類、黃酮類、多糖類、有機酸類等，具有抗炎解熱、抗血小板聚集、降脂抗動脈粥樣硬化等功效，其主要活性成分為知母多酚［1］。動物體內試驗表明［2］，知母多酚可顯著降低血糖水平，保護血管內皮，改善心血管并發癥。本文通過知母多酚對大鼠離體胸主動脈功能的影響，探討其對血管內皮的保護機制。

資料與方法

實驗材料:藥物與試劑:知母購于安徽亳州藥材市場，藥材批號:2011056，正丁醇(天津市達森制劑)，以芒果苷(上海同田生物有限公司生產，純度99.8%)為對照品;棕櫚酸，牛血清白蛋白(BSA)、胰島素注射液(上海第一生化藥業有限公司生產，批號:1105244)，重酒石酸去甲腎上腺素注射液(遠大醫藥有限公司);乙酰膽堿(Ach)、水楊酸鈉、D-葡萄糖、果糖、疊氮鈉均為分析純。

實驗動物:雄性SD大鼠，購自北京實驗動物研究中心，合格證編號:0002461;動物采用分籠飼養，保持室溫21℃ ±3℃。

儀器:JH-2型肌張力傳感器、HW-400E恒溫平滑肌槽、BL-420F型生物機能實驗系統，RF-5301PC型島津熒光分光光度計。

統計學分析:測量數據采用SPSS19.0進行分析，以表示，采用單因素方差分析和t檢驗進行統計學分析，P＜0.05有統計學差異。

實驗方法:(1)知母多酚的提取:取20g知母藥材適當粉碎，分別以10倍量和6倍量水煎煮2次，過濾，合并濾液濃縮至1g/ml，加乙醇至含醇量70%，回收乙醇得流浸膏，加水至0.5g/ml，先調pH值至3，正丁醇萃取3次，取正丁醇層，再調pH值至7，用水萃取3次，得水層，最后調pH值至3，正丁醇萃取3次，回收正丁醇，得知母多酚，收率為3.4%。⑵知母多酚與大鼠胸主動脈舒張反應:選取體重在150～200g的雄性 SD大鼠，剪頭處理后迅速取出胸主動脈，將其置于K-H液中并通入95%O2和5%CO2的混合氣體，分離血管周圍組織，祛除血管中的血液，剪成長2～3mm血管環，固定于K-H液的浴皿中，通過張力換能器與生物機能記錄儀連接。給血管環施加2g左右的靜息張力，平衡1h后，加入高K+液，重復兩次，檢查標本活性，然后用K-H液洗滌至基線。待動脈環穩定后，先用1×10－6mol/L的NE收縮血管環，再用ACh累進劑量來舒張血管，待NE預收縮的血管舒張幅度＞80%時表示內皮完整。分組處理已平衡的主動脈環:①正常組:繼續平衡1h;②棕櫚酸損傷組:浴皿中加入0.1mmol/L棕櫚酸溫浴 30min;③知母多酚組:分別加入 0.01、0.1、0.3mg/mL 的知母多酚，30min后加入棕櫚酸，觀察其對血管張力的影響。在上述各組中依次間隔加入胰島素10－6、10－5、10－4、10－3mmol/L，觀察胰島素誘導的舒張百分比。⑶知母多酚與體外糖基化修飾蛋白質:用PBS與BSA 0.5%、D-葡萄糖5mmol、果糖5mmol、疊氮鈉0.02%配制反應液，將1.8mL反應液分裝于2.0ml的 EP 管內，再分別加入0.1ml1 ×10－2、8 ×10－3、6 ×10－3、4×10－3、2×10－3、1×10－3g/L 的知母多酚，將試管密封，在37℃下培育21d，形成糖基化修飾的白蛋白(AGE-BSA)，以鹽酸氨基胍為陽性對照，另加空白糖基化系統、無蛋白的空白組、無糖空白組，每組設4個復孔。采用熒光光譜分析法，在激發波長370/發射波長450nm測定其吸收光譜，計算AGE-BSA含量。結果以熒光值表示，組間采用t檢驗。

結果

知母多酚對大鼠胸主動脈舒張反應的影響:經不同濃度知母多酚預處理后，可明顯改善受胰島素調節的內皮依賴性血管舒張，其中高劑量組與棕櫚酸損傷組比較有顯著差異(P＜0.05)，表明知母多酚可保護血管內皮，且作用程度與濃度呈梯度依賴性。

知母多酚對體外糖基化修飾蛋白質的抑制:實驗表明陽性對照氨基胍鹽酸鹽的抑制率為76.22%;知母多酚(10－2g/L)的抑制率高達98.97%，說明知母多酚能顯著抑制體外生成糖基化產物。

討論

知母多酚對血管內皮的作用:內皮細胞中L-精氨酸可在酶的作用下釋放的NO，NO經擴散與細胞膜上的鳥苷酸環化酶結合后激活環化鳥苷酸(cGMP)，從而舒張血管平滑肌。適當濃度的胰島素可促進一氧化氮合酶(eNOS)的表達，促進NO的釋放;此外，胰島素可經蛋白激酶(MAPK)途徑刺激分泌內皮素(ET)-1，并促進E-選擇素的表達，從而隨機體適應性的調節血管的舒縮反應［3］。本實驗棕櫚酸的作用是刺激大鼠主動脈環，降低胰島素介導的主動脈舒張作用。對于棕櫚酸損傷VEC依賴性血管舒張功能和減少內源性NO釋放，知母多酚能夠顯著改善。

蛋白質非糖基化:體內還原糖與蛋白質中氨基結合形成可逆的Shiff氏堿中間體，進而形成穩定可逆的蛋白復合物1-氨基-1-脫氧-D酮搪(Amadori)，Amadori產物及其降解的羰基化合物與游離氨基反應生成具有熒光性的不可逆終產物AGEs，據研究表明，AGEs可滅活血管松弛因子，進而阻礙了NO介導的內皮細胞依賴性血管舒張，導致血管痙攣［4］。本實驗結果表明知母多酚可明顯抑制糖基化蛋白的生成。

1 Li Hua，Hongliang Li，Yige Bao，et al.Free fatty acids induce en-dothelial dysfunction and activate protein kinase C and nuclear fac-tor-κB pathway in rat aorta［J］.International Journal of Cardiology，2010:1-7.

2 Pramanik S，Das AK，Chakrabarty M，etal.Efficacy of alternate-day versus everyday dosing of atorvastatin［J］.Indian J Pharmacol，2012，44(3):362-365.

3 Yamagishi S.Role ofadvanced glycation end products(AGEs)and receptor for AGEs(RAGE)in vascular dam-age in diabetes［J］.Exp Gerontol，2011，46(4):217-224.

4 師怡，林建銀.基質金屬蛋白酶抑制劑與腫瘤的相關性研究新進展［J］.當代醫學，2009(6):12-14.