大鼠急性缺血性腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)及藥物對(duì)其的影響

葉素紅 陳衛(wèi)松 王曉蓉

(浙江大學(xué)金華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 金華 321000)

急性缺血性腦卒中在臨床上非常常見，具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率，已成為威脅人類健康的主要疾病之一。目前對(duì)缺血性腦卒中的腦保護(hù)研究日益受到重視，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞(AS)腦保護(hù)作用的研究一直倍受關(guān)注。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是AS胞漿內(nèi)一種重要的骨架蛋白，是AS特征性標(biāo)志蛋白〔1〕。GFAP在AS受到刺激引起反應(yīng)時(shí)表達(dá)發(fā)生變化，因此可用GFAP特異性地標(biāo)記AS，被認(rèn)為是AS活化的標(biāo)志。本研究擬探討甘露醇對(duì)缺血性腦損傷后AS活動(dòng)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 健康雄性SD大鼠，體重240～280 g，SPF級(jí)，每籠6～8只群養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為自由攝食、飲水，12 h光照。環(huán)境溫度18℃ ～20℃，相對(duì)濕度50% ～70%。試劑:10%水合氯醛，乙醚，肝素鈉;碘伏，75%酒精，0.9%生理鹽水;20%甘露醇(250 ml/袋)，注射用無(wú)菌用水;4%多聚甲醛，多聚賴氨酸;兔抗GFAP，生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)，3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 分組 按體重編號(hào)，采取讀取隨機(jī)數(shù)的方法將大鼠隨機(jī)分成0劑量組、小劑量組、中劑量組、大劑量組，以1∶2∶2∶2的比例分配，所有大鼠都建立缺血再灌注模型，最后每組6只大鼠入組。

1.2.2 大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)再灌注模型制作 稱重后經(jīng)腹腔按0.35 ml/100 g〔2〕注射水合氯醛麻醉，約6～10 min麻醉至仰臥不能自己翻正。固定大鼠，消毒、鋪無(wú)菌洞巾。完全暴露頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。ECA的分支枕動(dòng)脈不必結(jié)扎，不分離出ICA的第一個(gè)分支PPA〔3〕。ICA遠(yuǎn)端用微動(dòng)脈夾夾閉;距CCA分叉2～3 mm處將CCA剪一小口，插入栓線，栓線進(jìn)入ICA，輕柔推進(jìn)，插入深度距分叉處約(18.2±0.5)mm〔4〕。此時(shí)栓線頭端正好位于大腦前動(dòng)脈(MCA)起始部，栓線側(cè)壁即對(duì)MCA造成阻斷，造成單側(cè)MCAO模型。結(jié)扎血管、固定好尼龍線，將線頭埋入皮下，縫合皮膚。栓線堵塞后開始計(jì)時(shí)，2 h后用乙醚快速麻醉。輕柔拔出栓線約10 mm，在結(jié)扎線附近剪斷，縫合皮膚，制成缺血再灌注模型。

1.2.3 給藥 從大鼠建立缺血再灌注模型開始，通過大鼠尾靜脈用微泵緩慢注射甘露醇到大鼠體內(nèi)，6 h注射一次。采用小(10 ml/kg)、中(15 ml/kg)、大(20 ml/kg)〔5〕三個(gè)不同的劑量對(duì)模型組大鼠用藥，0劑量組注射等量的無(wú)菌注射用水。

1.2.4 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 麻醉蘇醒后即觀察大鼠:①神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)，并參考Longa等〔6〕的5級(jí)4分法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分:0分:無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:提尾不能伸展對(duì)側(cè)前爪;2分:行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走困難，并向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)障礙。②HE染色:將存活24 h或72 h的大鼠麻醉斷頭取腦，浸于4%多聚甲醛24 h，取出并切片做HE染色。造模成功率部分參考沈斌等〔7〕制定的標(biāo)準(zhǔn):以至少存活24 h、評(píng)分1～3分、HE染色可見明顯缺血灶為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 結(jié)果觀察 固定兩個(gè)人對(duì)所有入組的每只大鼠在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(再灌注后0 h、24 h、48 h、72 h)進(jìn)行 mNSS 評(píng)分;在72 h后斷頭取腦，約平對(duì)耳線前方5.4 mm的平面切斷大鼠腦，切取該切面前后3 mm的兩塊腦組織制作石蠟切塊，制作免疫組化切片。10×20倍顯微鏡下觀察缺血周邊GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，每個(gè)區(qū)域隨機(jī)選擇三個(gè)相鄰視野計(jì)算平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，含一個(gè)重復(fù)測(cè)量因素的兩因素定量資料用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，單因素多水平的定量資料用單因素方差分析，兩兩水平之間的比較用Tukey法或LSD法，兩變量間的相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，所有數(shù)據(jù)均由SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 模型組大鼠不同劑量甘露醇再灌注后不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn) 0劑量組的mNSS評(píng)分值和小、中、大劑量組的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.023、0.026、0.019，而不同劑量對(duì) mNSS值的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.972)。見表1。

2.2 模型組大鼠應(yīng)用不同劑量甘露醇3 d(72 h)后的缺血周邊區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的變化 不同劑量組缺血周邊GFAP數(shù)目不完全相同，0、小、中、大劑量組GFAP數(shù)目分別為15.79±3.21、22.19±2.98、25.30±2.16、24.62±3.83，Tukey HSD 法多重比較結(jié)果:0劑量分別和小、中、大劑量組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.010、0.008、0.004，LSD 法的結(jié)果亦類似。而小、中、大劑量組間經(jīng)Student-Newman-Keuls法和Tukey HSD法檢驗(yàn)，P=0.812、0.896。表明三個(gè)不同劑量組間缺血周邊GFAP數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 24只大鼠缺血再灌注72 h的mNSS和其對(duì)應(yīng)的再灌注72 h后的缺血周邊的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目直線相關(guān)分析 兩組數(shù)據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)為－0.828(P=0.005)，表明兩者具有負(fù)相關(guān)性。

表1 模型組大鼠使用不同劑量甘露醇后mNSS比較(x ±s，n=6)

3 討論

缺血性腦血管疾病是人類最常見的腦血管病之一，其中MCA是其好發(fā)部位，約占60%以上。大鼠腦血管與人類相似，故認(rèn)為大鼠是建立腦缺血模型的最佳動(dòng)物。甘露醇對(duì)缺血性腦損傷后AS活動(dòng)影響的研究鮮有報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)選擇了甘露醇這個(gè)實(shí)驗(yàn)因素，觀察較常用的甘露醇對(duì)急性缺血性腦損傷后AS反應(yīng)性活動(dòng)的影響。同時(shí)考慮到甘露醇脫水降顱壓作用有可能改善mNSS評(píng)分，本實(shí)驗(yàn)采用持續(xù)靜脈緩慢滴注的方法，使其脫水、降顱壓作用不明顯，減少該方面的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在急性缺血性腦損傷后用甘露醇，均有隨再灌注后時(shí)間增加而mNSS評(píng)分值變小的趨勢(shì)，但未用甘露醇組的評(píng)分值下降的幅度明顯比用了甘露醇的三組(小、中、大劑量組)小，由此可知應(yīng)用甘露醇比未用者可以明顯改善缺血再灌注后的mNSS值，而小、中、大劑量組間對(duì)降低再灌注后mNSS值幅度的差別不明顯，可認(rèn)為在一定程度上所用甘露醇的劑量對(duì)改善大鼠神經(jīng)功能缺損狀況無(wú)明顯影響。在再灌注后72 h，四個(gè)劑量組間缺血周邊的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目有明顯差別，未用甘露醇組(0劑量組)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯小于小、中、大劑量組，而后三組間未見明顯差別，由此可認(rèn)為，應(yīng)用甘露醇后可以明顯增加缺血再灌注后GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，而一定程度上尚未發(fā)現(xiàn)所用甘露醇的劑量對(duì)增加GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目有明顯影響。由于不同劑量甘露醇改善mNSS值及增加缺血周邊GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的趨勢(shì)類似，所以對(duì)再灌注后72 h的各組mNSS值和再灌注后72 h相應(yīng)各組的缺血周邊GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)評(píng)分值和缺血周邊GFAP陽(yáng)性細(xì)胞間均具有負(fù)相關(guān)性。缺血周邊GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目越多，大鼠mNSS值越小。故有理由推測(cè)AS數(shù)目增多可能是改善mNSS值的主要原因之一，可能有腦保護(hù)的作用，通過使缺血周邊AS反應(yīng)性增生，改善大鼠mNSS值是其可能的機(jī)制之一。但本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于:AS數(shù)目增多即反應(yīng)性活動(dòng)加強(qiáng)對(duì)腦組織具有利弊兩面性，急性腦損傷后缺血周邊AS反應(yīng)性活動(dòng)在何時(shí)利大于弊或何時(shí)弊大于利尚不清楚。故對(duì)界定急性腦損傷后缺血周邊AS反應(yīng)性活動(dòng)發(fā)揮腦保護(hù)和腦損傷作用的時(shí)間段，值得進(jìn)一步深入研究。

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