頭孢曲松預處理對局灶性腦缺血大鼠腦組織TLR4和TNF-α蛋白表達的影響

劉 暢 巴曉紅 閔連秋 劉學文 姜興千 程 雪

(遼寧醫學院附屬第一醫院神經內科，遼寧 錦州 121001)

近年來免疫炎癥反應在缺血性腦損傷中的作用已得到肯定。炎性細胞在腦缺血時激活，并產生級聯效應導致缺血部位的免疫炎癥反應，進而加重神經系統的損害。Toll樣受體(TLR)的發現促進了人們對炎性機制的理解。TLR4是小膠質細胞行使免疫功能的信號轉導受體之一，TLR4信號成為一個激活小膠質細胞和調節其功能的重要控制開關〔1〕。頭孢曲松能夠顯著改善缺血半暗帶內神經元的存活率〔2〕，但具體機制尚不清楚。本實驗研究頭孢曲松對局灶性腦缺血大鼠腦組織TLR4及TNF-α的作用，探討其神經保護作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 24只健康成年SD大鼠，雌雄各半，體重280～320 g〔由遼寧醫學院動物實驗中心提供，許可證號:SCXK(遼)2003-1007〕。隨機分為缺血組、頭孢曲松鈉預處理組及假手術組，每組8只。

1.2 給藥方法 頭孢曲松鈉:由上海新先鋒藥業有限公司提供(規格1.0 g，批號080560);TLR4和TNF-α試劑盒均購自武漢博士德生物試劑公司。預處理組每日腹腔注射(ip)頭孢曲松鈉，200 mg/kg，共5 d，假手術組和缺血組給予等量的生理鹽水腹腔注射，給藥方法及療程相同。

1.3 大鼠局灶性腦缺血模型的建立 參照文獻〔3〕，大鼠中動脈阻塞模型(MCAO)術前12 h禁食，以防手術時誤吸，不禁水。以10%水合氯醛麻醉，沿頸部正中行2～3 cm切口，分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈及翼腭動脈。結扎頸總動脈近心端及翼腭動脈，在頸總動脈分叉處結扎頸外動脈遠心端。于頸內動脈近心端置動脈夾夾閉，距頸總動脈分叉處近心端0.5 cm處將頸總動脈剪一小口，插入備好的尼龍線栓，去除動脈夾，沿頸內動脈輕輕向前推進至大腦前動脈(深約18 mm)，結扎頸內動脈并固定線栓。假手術組不插入線栓，其余過程相同。模型成功的判斷標準為大鼠即刻出現同側Horner征。

1.4 神經行為學評分 參考Zea Longa法〔4〕5分制評分標準:①0分:無神經缺損癥狀。②1分:輕微神經缺損癥狀，不能完全伸展對側前爪。③2分:中度局灶性神經缺損癥狀，爬行時向對側轉圈。④3分:重度局灶性神經缺損癥狀，行走時向對側傾斜。⑤4分:不能自發行走，意識改變。于大鼠MCAO術后約2 h清醒至24 h內進行3次評分，取平均值。

1.5 缺血腦組織TLR4和TNF-α免疫組化法檢測 術后24 h取材。水合氯醛腹腔注射麻醉后，于頸正中偏右切開，以4%多聚甲醛約50 ml局部灌流內固定后，斷頭取腦。依次酒精脫水，石蠟包埋，行5μm厚的連續切片。①常規脫蠟、水化;②高壓熱修復抗原;③滴加正常山羊血清封閉液;④滴加1∶100稀釋的TLR4及TNF-α一抗，4℃下過夜;⑤添加生物素化二抗;⑥滴加試劑SABC;⑦DAB顯色;⑧蘇木素復染;⑨脫水、透明、封片。于每片右側頂葉皮層和海馬CA1區各取10個高倍鏡視野(10×40)，胞質有棕色顆粒者為陽性細胞(TLR4及TNF-α蛋白陽性細胞均為胞質染色)，取每個視野陽性細胞數平均值。

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗，用x±s表示。

2 結果

2.1 各組大鼠神經行為學評分的變化 缺血組神經功能評分(2.48±0.93)較假手術組(0)顯著升高(P＜0.01)，頭孢曲松預處理組(1.52±0.80)則低于缺血組(P＜0.05)。

2.2 各組大鼠海馬CA1區TLR4表達的比較 假手術組可見存在少量TLR4陽性細胞;缺血組大鼠腦組織中TLR4陽性細胞率高于假手術組(P＜0.01);與缺血組比較，預處理組TLR4陽性細胞數顯著減少(P＜0.01)。見圖1和表1。

2.3 各組大鼠海馬CA1區TNF-α蛋白表達的影響 假手術組TNF-α少量表達，腦缺血組TNF-α表達迅速上升，部位主要分布于海馬組織和缺血半暗帶，與假手術組比較，有明顯差異(P＜0.01);與缺血組比較，預處理組TNF-α的表達量明顯降低(P＜0.01)。見圖2和表1。

圖1 3組大鼠腦組織TLR4蛋白的表達(SP，×400)

圖2 3組大鼠腦組織TNF-α蛋白的表達(SP，×400)

表1 各組TLR4和TNF-α陽性表達率的比較(x ± s，n=8)

3 討論

腦梗死后，壞死及缺血區域因急性缺血而觸發炎性瀑布反應，導致過度的炎性損傷，成為神經元死亡的重要機制之一〔5〕。研究表明，小膠質細胞數量的增加與缺血再灌注后腦損傷的程度呈正相關，即小膠質細胞的過度活化加重了缺血后腦損傷的發生〔6〕。

TLRs是一個介導天然免疫的古老家族，迄今為止至少有10種TLRs類型，其中對TLR4的研究最廣泛。TLR4在人和鼠腦中均有大量的表達，主要分布在小膠質細胞。研究表明，在炎癥損傷的過程中小膠質細胞是損傷遞質的主要來源，TLR4在誘導中樞神經損傷中發揮著關鍵作用〔7〕。TLR-4介導的信號轉導途徑包括髓樣分化蛋白88(Myd88)依賴性和非依賴性，激活后將信號傳遞至NF-κB，引起TNF-α、白介素、干擾素-β等炎性因子的瀑鏈式激活而產生生物學效應〔8，9〕。Cao 等〔10〕研究發現，腦缺血再灌注后TLR4缺陷的大鼠通過抑制小膠質細胞的激活，下調炎性細胞因子的產生來減少炎癥反應。

本實驗顯示頭孢曲松鈉可以顯著降低大鼠缺血腦組織中TLR4的表達水平，推測頭孢曲松鈉可能通過TLR4及其信號傳導通路抑制炎癥反應的發生。

TNF-α是重要的促炎反應介質，主要來源于活化的膠質細胞，特別是小膠質細胞，具有復雜的生物學活性〔11〕。目前認為，TNF-α介導了腦梗死后引起的炎性損傷〔12〕。目前認為，腦內TNF-α主要通過3條途徑加劇炎癥反應和神經細胞的損傷:①激活NF-κB途徑，導致炎性因子的大量表達，從而啟動炎癥級聯反應，加重神經損傷;②促進內皮細胞與白細胞黏附分子的表達，引起血管炎癥反應，增加了血管對外周炎癥細胞的通透性，從而加重腦缺血及腦水腫;③細胞內NO合酶的表達增加。

本實驗表明TNF-α參與了腦缺血炎性損傷過程。CTX通過抑制缺血后TNF-α的表達，減輕神經炎性反應。本實驗觀察到，對照組及頭孢曲松預處理組的對側皮質中均有TNF-α蛋白的表達，但表達量均小于缺血側。但在缺血對側的皮層中，TLR4的表達無明顯增加，但不能完全說明缺血對側的TNF-α可能與TLR4的激活無關，也可能與樣本量小有關，需進一步探討。

本文提示TLR4和TNF-α參與了缺血性腦損傷的炎性反應過程，頭孢曲松預處理具有抑制缺血后腦組織TLR4和TNF-α表達的作用，通過抑制損傷后炎癥反應發揮神經保護作用。但TLR4如何被激活，以及信號傳導過程有待于進一步研究。

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3 陳佳俊，石巖殊，韓雪梅，等.線拴法大鼠局灶性腦缺血模型(PMCAO)的實驗研究〔J〕.吉林醫學，2004;25(10):16-7.

4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20:84-91.

5 Denes A，Thornton P，Rothwell NJ，et al.Inflammation and brain injury:acute cerebral ischaemia，peripheral and central inflammation〔J〕.Brain Behav Immun，2010;24(5):708-23.

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7 Laflamme N，Echchannaoui H，Landmann R，et al.Cooperation between Toll-like receptor 2 and 4 in the brain ofmice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria〔J〕.Eur J Immunol，2003;33(8):1127-38.

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