大鼠骨髓間充質干細胞體外向心肌細胞誘導分化的機制

邸 軍 李梓菲 陳 艷 高 丹 張 蕾

(吉林省人民醫院病理科，吉林 長春 130021)

長期供氧供能不足會導致心肌細胞(MC)損傷及死亡，從而造成MC數量減少，進一步導致疤痕組織形成和心室重構，引起心臟功能受損甚至危害生命。目前的研究普遍認同MC是終末分化期永久細胞，不具有自我增殖的能力，受到損傷后細胞無法通過自身的增殖代替死亡細胞達到修復心肌的目的。近些年來細胞療法即利用細胞移植替代器官組織中損傷或死亡細胞的方法已經成為目前醫學研究領域的一個重點研究方向。骨髓間充質干細胞(BMSCs)的自我更新能力和多分化潛能使其成為細胞療法的重要種子細胞〔1，2〕。BMSCs在適當的條件下可以誘導分化為多種類型的細胞〔3～5〕。目前已經有實驗證明BMSCs可以在一定誘導條件下分化為MC，但是其具體機制并未完全闡明。本實驗試圖闡明其分化機制，為BMSCs在心血管疾病的治療應用上探索新的方法。

1 材料與方法

1.1 BMSCs的分離培養及體外擴增 無菌條件下分離大鼠乳鼠雙下肢股骨，應用PBS沖洗多次。將含10%FBS的L-DMEM完全培養基吸入含有肝素的注射器內，沖洗骨髓腔3～4次。將沖洗獲得的細胞懸液加入到含10%胎牛血清的L-DMEM完全培養液內，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入培養基，調整細胞數，以1×106cells/ml密度接種于培養瓶中，置37℃ 含有5%CO2培養箱進行培養，每3 d全量換液1次。待貼壁細胞生長達到80% ～90%融合后，應用0.25%胰酶與1 mmol的EDTA消化液消化，按1∶3比例傳代。

1.2 BMSCs的表型鑒定 應用0.25%胰酶與1 mmol的EDTA消化并收集細胞，將抗CD44、CD45、CD105抗體(Neomarker，USA)與細胞常溫下孵育30～40 min。PBS洗滌2次后，加入FITC熒光標記的二抗，4℃避光孵育。20～30 min后PBS沖洗2次，加500μl PBS重懸細胞，應用流式細胞儀進行熒光檢測與分析。對照組為未加一抗的細胞。

1.3 BMSC多向分化能力鑒定 取生長狀態良好的P5代BMSC，以1×104/孔細胞數加入到24孔細胞培養板內培養，待細胞生長到80%～90%融合后，分別加入成脂誘導培養基與成骨誘導培養基，誘導14 d后，采用細胞進行油紅O染色判定大鼠BMSC向成脂分化的能力，誘導21 d后，采用茜素紅染色判定大鼠BMSC向成骨方向誘導的能力。

1.4 BMSCs向心肌細胞的誘導分化及鑒定 選擇生長狀態良好的P5代BMSCs，以1×105/孔細胞數接種于置有蓋玻片的24孔板中，當細胞融合達到60% ～70%時，加入5-氮雜胞苷(5-Aza，USA)，其終濃度為10μmol/L，37℃孵育24 h后換成不含誘導劑的培養基繼續培養。對照組不加5-Aza誘導劑。將含有誘導后的BMSCs細胞的載玻片水化10 min，加入阻斷劑孵育30 min后PBS沖洗3次，滴加血清封閉30 min，接著滴加抗TroponineI(Neomarker，USA)一抗 20 μl，4℃ 過夜，PBS 沖洗 3次，滴加生物素標記的二抗，37℃作用30 min，PBS沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，37℃作用30 min，PBS沖洗3次，加入DAB顯色，蘇木精復染核，酒精系列脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.5 RT-PCR檢測RhoA基因表達 消化并收集5-Aza誘導前后的細胞，應用RNA提取純化試劑盒按照說明書步驟提取細胞總RNA。應用一步法逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄以及PCR反應，分別取兩組提取的RNA 500 ng，每組內分別加入RhoA基因上下游引物1μl，內參照 β-actin上下游引物各0.5μl以及PCR反應液，總體積為20μl。按照以下條件進行RT-PCR反應:50℃ 50 min RT反應，94℃ 2 min滅活 RTase，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s延伸，循環 40 次。PCR 產物應用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，拍照。引物序列:β-actin上游:5'-TGTATGCCTCTGGTCGTACC-3'，下游:5'-CAACGTCACACTTCATGATGG-3'，PCR產物片段417 bp;RhoA上游:5'-GTGATTGTTGGTGATGGAGC-3'，下游:5'-CTCGTGGCCATCTCAAAAAC-3'，PCR 產物片段 503 bp。

2 結果

2.1 BMSCs的形態學觀察 接種于培養瓶內的細胞在3～4 d后逐漸出現貼壁細胞，殘留的各種類型的血細胞通過完全換液在6 d后逐漸被除去。貼壁細胞呈長梭形，為單個或幾個細胞的克隆，細胞形態均一 。培養至10～18 d后，細胞生長達到80%～90%的融合，細胞克隆表達并相互重疊，但無接觸抑制現象。傳代后的BMSCs形態均一，生長旺盛，成纖維細胞樣緊密排列，細胞間界限不清。見圖1。

2.2 BMSC多向分化能力鑒定結果 BMSCs成脂誘導14 d后油紅O染色顯示細胞內有染成紅色的脂滴，并伴有脂肪空泡(圖1B)。BMSCs成骨誘導21 d后茜素紅染色顯示細胞有鈣化結節形成，為紅色的致密結節(圖1C)。

2.3 BMSCs免疫表型鑒定 流式細胞術檢測結果顯示，培養的BMSCs細胞表面表達CD44與CD105，細胞表達率為95%以上，而細胞基本不表達CD45，說明培養的細胞為間質來源。

2.4 BMSCs向心肌細胞誘導分化的形態學觀察及鑒定結果BMSCs經10μmol/L 5-Aza定向誘導24 h后，細胞形態變得不規則，部分細胞逐漸變長，2 w后細胞逐漸由長梭形變為多角形及星形，類似心肌細胞，TroponineI蛋白免疫組化檢測結果顯示向心肌方向誘導的BMSCs表達心肌細胞特異性TroponineI蛋白。見圖2。

2.5 RhoA基因RT-PCR檢測結果 BMSCs沒有檢測到RhoA基因表達，而誘導后的BMSCs檢測到RhoA基因表達。見圖3。

圖1 培養第5代的BMSCs及分化潛能

圖2 免疫細胞化學染色示TroponineI表達

圖3 RT-PCR檢測RhoA基因

3 討論

BMSCs作為細胞移植治療的重要來源細胞，具有取材方便，無倫理及移植免疫排斥等問題、該細胞體外容易培養以及大量擴增，同時容易定向誘導分化。目前，通過BMSCs誘導分化獲得心肌樣細胞的技術還不成熟。有研究結果顯示BMSCs應用5-Aza誘導分化后，能夠形成心肌肌管樣結構，并表達MC特異性表面抗原標記。因此說明BMSCs具有向心肌樣細胞分化的潛能，為BMSCs用于MC損傷后的修復提供了理論上的依據〔6〕。5-Aza現已成為誘導BMSCs向MC分化的常用誘導劑，但其原理尚未完全闡明，其機制可能是5-Aza控制干細胞向MC分化的相關DNA的去甲基化，啟動相關促進干細胞向MC分化的轉錄因子的表達。

本研究顯示培養獲得的BMSCs形態以及表面標志物符合間充質干細胞特點。說明本實驗獲取的細胞是純度較高的大鼠BMSCs，而且BMSCs已經成功向MC分化。

有研究顯示Rho/ROCK信號途徑在5-Aza促進BMSCs向MC分化的過程中發揮重要作用。RhoA是細胞內傳導抑制信號、參與信號級聯放大過程中及調控細胞支架動力學的關鍵物質。ROCK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞內參與細胞骨架動力學與DNA表達調控〔7〕。Rho調節ROCK活性，細胞處于靜息狀態時ROCK不具備酶活性，當Rho傳遞活化信號后，ROCK發生磷酸化并被激活，使肌球蛋白磷酸酶發生磷酸化并失去活性，導致細胞內肌球蛋白輕鏈脫磷酸化，引起肌動蛋白微絲骨架的聚合〔8〕。5-Aza能夠通過來誘導骨髓間充質干細胞向心肌細胞的分化。在實驗中我們發現，在BMSCs向心肌細胞分化過程中表達RhoA。因此，5-Aza促進BMSCs向MC分化可能是通過Rho/ROCK信號途徑來調控的。

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