T細胞斑點試驗在結核病中的診斷價值

劉艷

結核是我國的重大傳染病之一，也是威脅全球健康的呼吸道傳染病。近年來，結核病有明顯上升趨勢。據世界衛生組織估計，全球目前有約20億的人感染過結核分枝桿菌[1]。如何快速準確的診斷活動性結核患者對結核病的防控尤為重要。傳統的抗酸桿菌涂片敏感性僅有50%～60%。分枝桿菌培養是目前臨床上應用于結核病診斷的金標準，但其需等6～8周時間才能有結果，培養要求較高，培養陽性率偏低。目前對菌陰肺結核、兒童結核及肺外結核的診斷仍比較困難。本研究通過對49例確診結核患者及47例非結核患者行T-SPOT.TB檢查，探討其在結核病的臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料2011年3月～2012年8月我科收治菌陰結核及肺外結核（肺結核符合中華結核病診治指南診斷標準，淋巴結結核為病理證實，結核性胸膜炎、腰椎結核、結核球為治療隨訪后證實）患者49例（觀察組），平均年齡（47±19）歲，其中男27例，女22例。49例結核患者中，肺結核患者42例，結核性胸膜炎3例，腰椎結核1例，淋巴結結核2例，結核球1例。對照組47例，為經相關檢查及治療后排除結核感染的患者，其中男28例，女19例，平均年齡（53±19）歲。47例患者中，其中肺炎34例，陳舊性結核2例，胸腔積液2例，腹腔積液1例，慢性支氣管炎1例，發熱1例，惡性腫瘤3例，慢性咳嗽1例，腮腺腫大1例，間質性肺炎1例。兩組資料年齡、性別均無統計學差異。

1.2 試劑與方法 T-SPOT.TB：T-SPOT.TB試劑盒（上海復星科技有限公司提供）。肝素抗凝管采集8 mL外周靜脈血，離心分離外周血單核細胞（PBMC）。于顯微鏡下計數細胞數，配置每100微升含有25萬細胞的標準溶液。取出T-SPOT.TB試劑盒內微板孔，陰性對照加入細胞培養液，陽性對照加入植物血凝素，另外兩孔分別加入抗原A（ESAT-6）和抗原B（CFP-10）各50 μL，然后每孔加入100 μL含有PCMC的上述細胞懸液，置于CO2培養箱37℃溫度孵育16～20 h，用pH值6.8～7.2的PBS液洗脫，加入堿性磷酸酶標記的抗IFN-γ單克隆抗體50 μL，4℃孵育2 h，再用PBS液洗脫，每空加入顯色液50 μL。避光室溫靜置7 min，蒸餾水沖洗后觀察結果，用放大鏡人工計數每空斑點數。陽性結果定義為：當陰性對照孔點數為0～5時，測量孔點數減去對照孔點數≥6，當陰性對照孔點數≥6時，測量孔點數≥兩倍對照孔點數[2]。

結核菌素試驗（PPD）：PPD（結核菌素純蛋白衍生物，四川成都生物技術公司生產，50 U/mL），以5 U注入左前臂內側上中1/3交界處皮內，使之形成皮丘，48～72 h觀察反應，結果判斷以局部硬結直徑為依據，＜5 mm為陰性，5～9 mm為一般陽性反應，10～19 mm為中度陽性反應，≥20 mm或不足20 mm但有水皰或壞死為強陽性反應[3]。

結核抗體：采用膠體金標法，按試劑說明書操作。結核抗體檢測試劑由MP生物醫學亞太私人有限公司提供。

1.3 統計學方法 應用SPSS 12.0軟件進行統計分析，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

觀察組中47例T-SPOT.TB檢測陽性，敏感性為95.9%，與PPD及結核抗體比較，差異具有統計學意義（P＜0.01）。對照組中，2例T-SPOT.TB陽性，特異性為95.7%，與PPD及結核抗體比較，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 T-SPOT.TB試劑與PPD、結核抗體結果比較[n（%）]

3 討論

近年來，結核病的發生率呈明顯上升趨勢。據估計2010年，全球新增結核病例共880萬例，約145萬患者死于結核感染[4]。我國是世界上僅次于印度的第二個結核病高負擔國家，結核感染率為44.5%，活動性結核患者450萬，每年死亡人數達13萬[5]。我國是全球22個結核病高負擔國家之一，2000年中國第四次全國結核病流行病學調查資料[5]顯示，活動性肺結核患病率為367/10萬，菌陽肺結核患病率為160/10萬，涂陽肺結核患病率為122/10萬。而這一數據現仍呈上升趨勢。

結核菌的病原學檢查是診斷結核的金標準，但其受標本中細菌的數量影響大，常規培養需要時間長，且培養陽性率偏低，不利于肺結核的早期發現、診斷與治療。PPD試驗是目前篩查結核感染的主要防范，但其某些抗原成分與卡介苗及非結核性分枝桿菌抗原成分相同，易發生交叉反應，從而導致假陽性的發生，且對于老年患者、免疫抑制、重癥、HIV感染及移植患者，存在假陰性[6-7]。此外，皮試操作和結果存在主觀性，從而進一步降低其檢查的準確性。因此尋找快速、高效診斷活動性結核病的診斷方法尤為重要。T-SPOT.TB檢查是以特異性抗原為刺激源，應用酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）診斷結核病的新方法，其具有較高的敏感性和特異性，且耗費時間較短，僅1 d。

Ma-hariras等[8]在1996年發現結核分枝桿菌中存在一段名為“RD 1”的基因序列。1999年，Behr等[9]應用基因芯片技術將結核分枝桿菌標準株H 37 Rv和BCG的全基因組進行比較，發現129個只存在于結核分枝桿菌而BCG缺失的開放讀碼框，其被劃分為16個區域，后分別被命名為RD 1～RD 16，其中RD 1被證實為結核分枝桿菌所特有，在卡介苗菌株中均不存在。RD 1編碼產生兩種蛋白：CFP-10和ESAT-6，為結核分支桿菌特異性蛋白。結核感染人體后，體內產生特異性的記憶性T淋巴細胞，當抗原再度刺激時，其能產生特異性的細胞因子IFN-γ。Lalvani等[10]以CFP-10和ESAT-6混合抗原多肽為刺激源刺激這些記憶性T淋巴細胞，使其分泌IFN-γ，檢測其細胞數，從而發現診斷結核感染的T-SPOT.TB這一新方法。

目前大量研究證實T-SPOT.TB檢測對于結核感染具有較高的敏感性和特異性。Pai等[11]的meta分析提示T-SPOT.TB診斷結核病的敏感性為90%。Dai等[12]最新的meta分析提示T-SPOT.TB診斷結核病的敏感性和特異性分別為88%和89%。而在免疫抑制患者中，T-SPOT.TB同樣顯示出較高的敏感性和特異性。Chapman等[13]的研究顯示，39例HIV陽性的結核患者中T-SPOT.TB的敏感性為90%，而PPD皮試僅為72%。Kim等[14]研究顯示，72例肺外結核患者的T-SPOT.TB和PPD的敏感性分別為94%和47%，差異具有統計學意義（P＜0.001）。Liao等[15]的研究結果同樣顯示，T-SPOT.TB在肺外結核患者中有較高的敏感性和特異性，診斷的敏感性達到95%以上。國內霍菲菲等[16]的資料顯示T-SPOT.TB在31例細菌學或組織學確診的肺外結核患者中的敏感性為93.5%。我們的結果與國內外的報道相一致，T-SPOT.TB在診斷結核的敏感性和特異性分別為95.9%和95.7%，與PPD、結核抗體相比起具有更高的敏感性和特異性。

結核病很多沒有特異性的臨床表現，且PPD、結核抗體檢測、抗酸桿菌涂片菌均因其敏感性和特異性不夠，因此臨床常對結核病出現漏診、誤診。結核菌陽性率不高且培養時間較長，一般均在患者出院后才能出具報告，限制了其在臨床上的應用。而T-SPOT.TB在診斷結核病方面有著較高的特異性和敏感性，且時間短，24 h內即可出具結果，因此在輔助結核病的診斷方面有著較高的應用價值，值得在臨床上推廣應用，為患者早期診斷、早期治療提供幫助。

[1]Jasmer RM,Nahid p,Hopewell PC. Latent tuberculosis infection[J].N Engl J Med,2002,347(23):1860-1866.

[2]張瑛，孫亞蒙，徐欣暉等.結核感染T細胞斑點試驗在結核性疾病中的診斷價值[J].中華臨床醫師雜志（電子版）,2010,4(12):2431-2434.

[3]陳灝珠，林果為.實用內科學[M].北京：人民衛生出版社,2010:600.

[4]World Health Organization.Global Tuberculosis Report 2011[M].Geneva:World Health Organization 2011：10.

[5]全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組.2000年全國結核病流行病學抽樣調查報告[J].中國防癆雜志，2002，24(2):65-66.

[6]Lee E,Holzman RS.Evolution and current use of the tuberculin test[J].Clin Infect Dis.2002.34(3):365-370.

[7]Andersen P,Munk ME,Pollock JM,et al.Specific immune-based diagnosis of tuberculosis[J].Lancet.2000,356(9235):1099-1104.

[8]Mahairas GG,Sabo PJ,Hickey MJ,et al.Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis[J].J Bacteriol,1996,178(5):1274-1282.

[9]Behr MA,Wilson MA, Gill WP,et al.Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray[J].Science,1999,284(5419):1520-1523.

[10]Lalvani A.Diagnosing tuberculosis infection in the 21 st century:new tools to tackle an old enemy[J].Chest,2007,131(6):1898-1906.

[11]Pai M, Zwerling A,Menzies D.Systematic review:T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosisinfection:an update[J].Ann Intern Med,2008,149(3):177-184.

[12]Dai Y,Feng Y,Xu R,et al.Evaluation of interferon-gamma release assays for the diagnosis of tuberculosis:an updated meta-analysis[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2012,31(11):3127-3137.

[13]Chapman AL,Munkanta M, Wilkinson KA,et al.Rapid detection of active and latent tuberculosis infection in HIV-positiveindividuals by enumeration of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells[J].AIDS,2002,16(17):2285-2293.

[14]Kim SH,Song KH,Choi SJ,et al.Diagnostic usefulness of a T-cellbased assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients[J].Am J Med,2009,122(2):189-195.

[15]Liao CH,Chou CH,Lai CC,et al.Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease[J].J Infect,2009,59(6):402-408.

[16]霍霏霏，張麗帆，劉曉清.評價γ干擾素釋放分析T-SPOT.TB在肺外結核病診斷中的敏感性[J].中國醫學科學院學報，2009，31(4):449-452.