山葡萄轉色期果皮轉錄因子MYB基因的克隆與分析

楊天天，王曉平，楊成君，尉建平，李 波，王 軍

(1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.中國農業大學食品學院，北京 1000085)

山葡萄是中國重要的野生果樹資源，具有極強的抗寒性，是東北地區釀造葡萄酒的主要原料［1］。果實色澤是評價果實品質的重要指標之一，尤其對于紅色釀酒葡萄品種。果實的顏色決定了葡萄酒的色澤和品質，而花色苷又是決定果實著色的主要物質，分布于果皮、果肉和葡萄籽等處，其中，果皮含量最高［2］。轉色期作為非躍變型果實特有的一個生長階段，是漿果在大小、硬度、色澤以及內部生理特點發生劇烈變化的時期［3］。轉錄因子(Transcription factor，TF)也稱反式作用因子，是指能與真核基因啟動子區域中的順式作用原件發生特異性結合，通過它們之間以及與其他相關蛋白質元件的相互作用，激活或抑制轉錄，從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間下表達蛋白質分子。在植物生長發育及其對外界環境的反應中起著重要的調控作用［4］。在葡萄中，對MYB基因功能的研究主要集中在通過控制類黃酮糖基轉移酶基因的表達調控花青素的生物合成，MYB5a、MYB5b、MYBPA1 和MYBPA2都參與了類黃酮的代謝［5-10］，葡萄全基因組108個R2R3 MYB基因已公開發表［11］。

本研究擬從山葡萄轉色期果皮cDNA文庫中分離得到一段與轉錄因子MYB相關的基因片段，并進行生物信息學分析，旨在為闡明山葡萄花色苷的生物合成及調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

山葡萄品種雙豐(Vitis amurensis cv.Shuang Feng)采自中國農業科學院特產研究所國家山葡萄種質資源圃。在果實轉色期(50%著色)采摘，采后洗凈擦干，立即置于液氮中冷凍，于-80℃冰箱保存，取果皮作為供試材料。

大腸桿菌(E.coli)DH5α、pMD18-T 載體、膠回收試劑盒、Ex Taq聚合酶、PrimeScriptTMRT REAGENT Kit均購自TaKaRa，其他試劑為國產分析純。DNA測序由北京華大生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取、純化和cDNA合成 采用改良的 CTAB法［5］提取總 RNA，并進行純化，按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent試劑盒說明書合成cDNA，保持環境低溫。

1.2.2 RT-PCR合成目的基因片段 首先構建山葡萄轉色期果皮cDNA文庫，并進行EST測序和生物信息學分析。從中選取一條與轉錄因子相關的基因片段(02_H07)，使用BlastN程序將其在NCBI上進行同源基因比對，發現該序列與葡萄雜交種Colobel、Vintinto的轉錄因子 MYBA3基因相似性達到98%，與歐亞種葡萄VvmybA1相似性達97%，與歐亞種和美洲種的雜交品種的VlmybA1-1和VlmybA1-2的相似性分別為97%和96%。由搜索結果可以看出，MYB類基因保守區和兩端非編碼區的序列相似性極高，因此可以選取一個相似性最高的品種，根據其全長序列在兩端分別設計特異引物。本研究利用Primer 5.0設計了3對特異引物，相關引物名稱、引物序列和退火溫度等信息見表1。

表1 合成目的基因片段的引物序列Table 1 Primer used for amplifying target gene fragments

3個PCR管分別標記為A、B、C。將已獲得cDNA作為模板，利用特異引物進行PCR反應。PCR反應體系及條件:10× Ex Taq Buffer 2.0 μl，引物(10 μmol/L)各 1.0 μl，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1.6 μl，MgCl2(2.5 mmol/L)1.2 μl，TaKaRa Ex Taq酶(5 U/μl)0.5 μl，模板 cDNA(20 ng/μl)2.0 μl，ddH2O 10.7 μl。94℃預變性5 min;94℃變性30 s，退火30 s(溫度見表1)，72℃延伸X，35個循環;72℃延伸7 min。延伸時間X根據預期PCR片段確定，1000 bp以內為90 s，每超過500 bp延長30 s。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，于凝膠成像系統下成像觀測。

1.2.3 PCR產物的DNA片段回收和連接 按照膠回收試劑盒說明書(購自上海寶生物公司)對PCR產物的DNA片段進行回收、連接與轉化。對片段進行切割時，要盡可能減少DNA片段的損失，也要盡可能避免在紫外燈下照射過長時間。將回收的DNA片段與載體pMD-18連接，16℃連接過夜。反應體系為 10.0 μl，其中 DNA 片段 4.5 μl、pMD-18載體 0.5 μl、Ligation Mix 5.0 μl。

1.2.4 轉化 將50 μl DH5α感受態細胞在冰上解凍后加入5 μl連接產物，加入預熱的LB培養基，取適量菌液，涂布于含有50 μg/μl的氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養基平板上，過夜。次日，挑菌并置于37℃培養箱中振蕩培養6～8 h。隨后進行菌液PCR，反應體系和程序同前。反應結束后取5 μl PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測是否有相應大小的條帶，隨后將菌液送往北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，剩余菌液加入適量甘油置于-80℃保存。

1.2.5 目的基因的序列分析 對測序后的目的基因片段應用Vector NTI Suite 9.0軟件去除載體序列后拼接獲得cDNA全長，應用DNAStar軟件對獲得的目的基因全長cDNA序列進行開放閱讀框分析，并推導出相應的氨基酸序列。利用BLASTP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastp)程序在 NCBI上進行氨基酸相似性比對分析，應用pfam24.0(http://pfam.sanger.ac.uk/search/sequence)對該基因進行家族預測。運用Protparam軟件(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)預測蛋白質的分子質量、等電點及基本性質。信號肽分析利用Signalp 3.0 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/Signalp)。跨膜區預測利用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)。疏水性分析和二級結構預測分別在http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl和http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPS/npsa_hnn.html網站進行。應用ClustalX 2.1對不同植物相關基因氨基酸進行多重比對，利用MEGA 4軟件繪制系統發育樹。

2 結果

2.1 總RNA的提取

采用改良CTAB法提取山葡萄轉色期果皮總RNA，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，點樣孔處沒有亮帶，且條帶兩側沒有明顯的彌散，亮度接近于2∶1，表明總RNA沒有降解，較完整。總RNA的純度使用核酸測定儀測定，紫外吸收值OD260/OD280為1.99，OD260/OD230為2.14，表明 RNA均一性較好，1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示。

圖1 山葡萄總RNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from Vitis amuerensis

2.2 全長序列克隆

以提取總RNA反轉錄合成的cDNA為模板，用3對特異引物AF/AR、BF/BR、CF/CR進行PCR擴增，只有特異引物BF/BR獲得了目的基因特異條帶，電泳結果如圖2所示，對750 bp左右的目的片段，進行回收、連接、轉化。在目的片段轉化平板后，隨機挑取單克隆，加入含有氨芐青霉素(Amp)50 μg/μl的液體培養基中，37℃培養后，進行菌液PCR檢測，電泳結果如圖3所示，獲得長約750 bp的基因片段。

圖2 山葡萄MYBA3基因cDNA片段電泳檢測Fig.2 Agarose gel electrophoresis of cDNA fragment of Vitis amuerensis MYBA3 gene

2.3 全長序列分析

菌液測序委托北京六合華大基因科技股份有限公司。將獲得的測序結果應用Vector NTI Suite 9.0軟件去除載體序列，然后拼接獲得一段目的基因片段，通過BLAST程序在NCBI上進行同源搜索比對，結果顯示該片段為山葡萄MYBA3的全長片段。應用DNAStar軟件進行cDNA序列開放閱讀框的分析并推導出相應的氨基酸序列。結果顯示，該基因全長764 bp，包括開放閱讀框753 bp和11 bp的3'-非翻譯區(3'-UTR)。推測基因的開放閱讀框編碼250個氨基酸，分子量為 28680，等電點為7.49。負電荷殘基(Arg+Lys)數為35個，正電荷(Asp+Glu)數為35個，不穩定系數為37.69，系穩定蛋白質。開放閱讀框推導的相應氨基酸序列如圖4所示。

圖3 山葡萄MYBA3基因插入片段的PCR檢測Fig.3 PCR detection of MYBA3 inserts of Vitis amuerensis

圖4 山葡萄MYBA3基因序列及由此推導的氨基酸序列Fig.4 Nucleotide and deduced amino acid sequences of MYBA3 gene from Vitis amuerensis

利用NCBI的BlastP在線比對軟件，在蛋白保守區數據庫(Conserved domin database，CDD)，對山葡萄基因 MYBA3推導的氨基酸序列進行蛋白質保守區預測。結果(圖5)表明，該基因具有兩個保守區，屬于SANT超基因家族，從第8個氨基酸到第55個氨基酸和從第61個氨基酸到第106個氨基酸，分別匹配48個和46個氨基酸長度。

應用ProScale在線軟件，以默認算法(Hphob.Kyte＆Doolittle)對該基因推導的氨基酸序列進行蛋白質疏水性預測，結果(圖6)顯示，蛋白質疏水性最大值為1.367，最小值為-3.100，疏水平均值為-0.867，具有一定的親水性。用TMHMM-2.0進行蛋白質序列的跨膜區分析，結果如圖7所示，推測該蛋白質可能不具有跨膜區，主要是在膜外進行作用。信號肽分析表明該蛋白不具有信號肽。二級結構則主要是以α-螺旋和不規則盤繞為蛋白質最大量的結構原件。

圖5 推導的氨基酸序列的保守區預測Fig.5 Search for conserved domains in deduced sequence of amino acid

圖6 蛋白疏水性分析Fig.6 Hydrophobicity profiles of the protein

圖7 跨膜區預測Fig.7 Prediction of transmembrane domain

用推導的氨基酸序列與蛋白質數據庫中的調節基因的編碼氨基酸序列進行同源性比較，結果見圖8。其中，山葡萄氨基酸序列與歐亞種葡萄、葡萄雜交種、煙草、牽牛花、酸櫻桃、楊梅、朝天椒和甜杏仁的氨基酸序列相似系數分別為97%、98%、55%、55%、53%、51%、45%和49%。

用MEGA 4軟件對該基因及其他植物調節基因的氨基酸序列進行多序列比對，繪制分子進化樹(圖9)。結果表明，山葡萄轉錄因子MYBA3基因與同種屬的歐亞種葡萄(V.vinifera)、葡萄雜交種(V.hybrida cultivar)轉錄因子的親緣關系最近，與其他物種如楊梅(M.rubra)、朝天椒(C.annuum)、酸櫻桃(P.cerasus)、煙草(N.tabacum)、甜杏仁(P.dulcis)的調節基因的親緣關系很遠。

3 討論

以cDNA文庫為信息來源，從中分離并克隆到山葡萄花色苷生物合成途徑中的轉錄因子MYBA3基因，并對該基因的結構、蛋白質結構等進行了分析，結果表明，該基因cDNA全長序列為764 bp，編碼250個氨基酸，與歐亞種葡萄(V.vinifera)相關基因的序列相似性達到了97%，與葡萄雜交種(V.hybrida)相似性達到了98%。氨基酸序列比對與進化樹分析說明，MYBA3基因與歐亞種葡萄和葡萄雜交種MYBA3基因同源性較高。該基因不具有信號肽結構，而具有一定的親水性，二級結構以α-螺旋和無規則卷曲為蛋白質最大量的結構元件。轉錄因子調節基因控制花色苷生物合成過程中相關結構基因的時空表達，影響花色苷生物合成的強度和模式［12］。MYB類轉錄因子是植物體內調節各種生理代謝反應的關鍵因子，具有高度保守的DNA結合區和MYB區，它們高度保守的DNA結合域使得利用PCR方法分離克隆MYB基因家族成員成為可能。MYB基因的分離克隆可以為研究者提供這類轉錄因子在轉錄水平對植物某些生理過程調控機制的相關信息［13］。MYB蛋白家族功能復雜多樣，對MYB轉錄因子在植物生長發育及生理代謝中的調控機理的深入研究和解析，尚有賴于大量MYB轉錄因子基因及相關基因的克隆和表達分析的驗證。

圖8 MYBA3基因推導的氨基酸序列的多重比對Fig.8 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of MYBA3 gene

圖9 由MYBA3基因推導的氨基酸構建的分子進化樹Fig.9 Molecular phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of MYBA3 gene

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