瘦素降低全反式維甲酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白過度磷酸化

梁 辰，鄧子輝，張金英，郝秀華，薛 輝，顏光濤

解放軍總醫(yī)院 基礎(chǔ)所生化室，北京 100853

阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要臨床癥狀。臨床病理研究發(fā)現(xiàn)AD患者的癡呆癥狀嚴(yán)重程度與腦組織中神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)數(shù)量呈正相關(guān)，而NFTs的主要成分是過度磷酸化tau蛋白[1]。因此針對(duì)tau蛋白可能成為預(yù)防和治療AD的理想途徑。瘦素(leptin)是一種主要由脂肪組織分泌的分子量為16 kU的多肽。它由ob基因編碼，含有167個(gè)氨基酸，而血液中的leptin是去掉N端21個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽后形成的146個(gè)氨基酸的多肽[2]。具有抑制食欲、增加能量消耗、促進(jìn)脂肪分解、減輕體重等生物學(xué)功能。近年的研究發(fā)現(xiàn)，瘦素受體(ObR)在腦內(nèi)廣泛表達(dá)，分布在下丘腦、海馬、小腦和大腦皮質(zhì)等，瘦素作用于這些腦區(qū)可改變神經(jīng)元或突觸的結(jié)構(gòu)、功能及其可塑性，影響神經(jīng)元存活或增殖，并改善學(xué)習(xí)、記憶及其他認(rèn)知功能[3-4]。本研究通過檢測AD細(xì)胞模型中磷酸化tau蛋白水平的變化情況，探討leptin與阿爾茨海默病的整體關(guān)系，以及l(fā)eptin對(duì)磷酸化tau蛋白的調(diào)節(jié)作用。

材料和方法

1 材料 人神經(jīng)纖維母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y(本實(shí)驗(yàn)室保存)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Gibico)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)(北京益利精細(xì)化學(xué)品公司)；Western Blot超敏發(fā)光液、RIPA裂解液、Trizol RNA提取試劑、BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)公司)；一抗：p-tau(ser396)(sc-101815)、tau(TAU-5)(sc-58860)、Actin(sc-1616-R)、Ob-R(sc-8391)(Santa Cruz Biotechnology)；二抗：山羊抗小鼠IgG/辣根酶標(biāo)記、山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記(北京中杉金橋公司)。Human Ob-Rb：94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，40循環(huán)，72 ℃ 10 min。Forward：5'-GCCAACAACT GTGGTCTCTC-3'；Reverse：5'-AGAGAAGCACTTG GTGACTG-3'。內(nèi)參GAPDH 246 bp，95 ℃ 50 s，54 ℃50 s，72 ℃ 1 min，30循環(huán)，72 ℃ 7 min。Forward：5'-CCCCTTCATTGACCTCAACTAC-3'；Reverse：5'-G AGTCCTTCCAGGATACCAAAG-3'(北京賽百盛公司)。

2 MTT法檢測ATRA濃度梯度對(duì)細(xì)胞活性的影響將SH-SY5Y消化、收獲、計(jì)數(shù)，各組取5×104/ml細(xì)胞100 μl接種到96孔板，每組兩列10個(gè)平行孔。加入ATRA濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L，培養(yǎng)6 d后，每孔加入四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，濃度為5 mg/ml)100μl，置于37 ℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜100 μl，震蕩5 min，用酶標(biāo)儀在570 nm處讀取吸光度值(A值)，取平均值為細(xì)胞增殖水平。

3 ATRA誘導(dǎo)AD模型的建立 培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞豐度達(dá)到60%，倒掉原有培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，加入含有ATRA(40 μmol/L)不含血清的DMEM培養(yǎng)基中，連續(xù)誘導(dǎo)6 d建立模型，加入leptin(0.5 μg/ml)作用12 h。

4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以1×106個(gè)/孔種于6孔板中，ATRA誘導(dǎo)，分為對(duì)照組、模型組，分別于4 h、1 d、2 d、6 d時(shí)間點(diǎn)置于倒置顯微鏡下觀察，并拍照。

5 RT-PCR檢測Ob-Rb mRNA的表達(dá) 用Trizol RNA提取試劑抽提細(xì)胞中總RNA，以O(shè)b-Rb引物在反轉(zhuǎn)錄酶作用下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，隨后進(jìn)行33個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增。同時(shí)，PCR擴(kuò)增管家基因GAPDH作為參照。

6 Western Blot檢測p-tau表達(dá)水平 用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法蛋白定量。蛋白上樣量為30 μg，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的PAGE上進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜上(100 V，1.5 h)。將NC膜放入封口塑料袋中，加入含5%脫脂奶粉(TBS/T溶解，下同)，4 ℃封閉過夜后，將NC膜轉(zhuǎn)入另一封口塑料袋中，分別在不同的膜中加入稀釋好的一抗p-tau、Tau-5(各1∶1 000)。37 ℃孵育1 h，TBS/T漂洗NC膜3次，每次10 min。再向膜中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG抗體(1∶2 000)，37 ℃孵育40 min，TBS/T漂洗NC膜3次，每次10 min。加入發(fā)光液，暗室曝光，使用凝膠掃描儀測其灰度值。使用軟件計(jì)算p-tau灰度值比(p-tau 5/Tau-5)，組間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Stata7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以-x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)， P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ATRA對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響 MTT法檢測SH-SY5Y細(xì)胞增殖水平顯示，ATRA誘導(dǎo)組在40 μmol/L濃度下A值明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，5、10、20 μmol/L ATRA誘導(dǎo)組A值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1。

圖 1 MTT實(shí)驗(yàn)后各組A值(aP＜0.01, vs control)Fig. 1 A value for each group after MTT assay(aP＜0.01, vs control)

2 ATRA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響 正常SHSY5Y細(xì)胞接種4 h時(shí)尚未分化，呈略圓形特征，并少見短形突起(圖2A)；貼壁生長后1 d展現(xiàn)出更類似于神經(jīng)元的表型，大小不一，呈不規(guī)則形，圓形特征丟失，少見梭形(圖2B)；連續(xù)加入ATRA處理2 d，開始展現(xiàn)神經(jīng)元的形態(tài)，即軸突開始生長(圖2C)；ATRA連續(xù)處理6 d，細(xì)胞呈現(xiàn)出成熟神經(jīng)元的形態(tài)，軸突伸展并時(shí)而與相鄰細(xì)胞連接(圖2D)。

圖 2 倒置顯微鏡下ATRA誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)(200×)Fig. 2 Cell morphology before and after ATRA induction was observed by inverted microscope(200×)

3 ATRA誘導(dǎo)后ObRb mRNA表達(dá)變化 誘導(dǎo)組ObRb mRNA表達(dá)顯著升高，提示AD模型建立后leptin發(fā)揮作用，見圖3。

4 Leptin處理后p-tau蛋白表達(dá)變化 Western Blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，ATRA誘導(dǎo)模型后p-tau蛋白表達(dá)水平明顯增加(P＜0.01)，說明模型建立成功，加入leptin(0.5 μg/ml)作用12 h后，與模型相比有明顯降低(P＜0.01)，見圖4。

圖 3 RT-PCR檢測ObRb mRNA表達(dá)(P＜0.01)Fig. 3 RT-PCR showing expression of ObRb mRNA(P＜0.01)

圖 4 Western Blot檢測p-tau蛋白的表達(dá)(aP＜0.01, vs control)Fig. 4 Western blot showing expression of p-tau protein(aP＜0.01,vs model)

討 論

神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)是AD的兩種最為主要的病理特征之一，主要存在于患者的海馬、杏仁核、前額葉等部位[5]。NFTs主要由過度磷酸化的tau蛋白聚集而形成，tau蛋白在亞細(xì)胞水平上主要定位于細(xì)胞質(zhì)，大多在中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域神經(jīng)元的軸突表達(dá)[6]。它通過與多種蛋白相互作用來行使其功能，例如tau蛋白可以結(jié)合并穩(wěn)定微管系統(tǒng)，可提高體外培養(yǎng)神經(jīng)元突觸的生長速率和范圍。

Tau有著不同的聚集狀態(tài)，其中可溶性的寡聚體比大分子、不溶性的高度成纖維聚集體更具致病性[7]。Tau蛋白可以被多種蛋白激酶磷酸化，例如：AMP活化的蛋白激酶、應(yīng)激活化的蛋白激酶、糖原合成酶激酶3、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5、促分裂原活化的蛋白激酶、酪蛋白激酶、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶Ⅱ、微管親和調(diào)控蛋白激酶、蛋白激酶A等[8]。迄今為止，圍繞關(guān)注于tau蛋白的異常磷酸化以及tau與AD之間的關(guān)系的研究逐漸深入，干擾tau蛋白的過度磷酸化被認(rèn)為是神經(jīng)退行性疾病治療的關(guān)鍵[9]。

瘦素主要由白色脂肪組織分泌，通過下丘腦來調(diào)節(jié)新陳代謝、攝食、能量平衡等生理活動(dòng)。Vannucci等[10]研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠與正常小鼠比較其大腦體積明顯縮小，并伴有神經(jīng)元密度減低和功能下降，提示leptin可能參與神經(jīng)系統(tǒng)生理活動(dòng)。

本研究中，檢測到細(xì)胞瘦素受體(ObRb)mRNA表達(dá)升高，提示leptin可能在此損傷中發(fā)揮直接的作用；在給予外源性leptin作用后，檢測到p-tau蛋白水平也顯著降低，提示leptin可能通過降低p-tau蛋白的表達(dá)對(duì)AD起到改善作用。從而認(rèn)為leptin可能作為阿爾茨海默病治療的新靶點(diǎn)，其作用機(jī)制值得深入研究。

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