血脂平穩度對兔動脈粥樣硬化病變進展的影響

鄒 曉，司全金，蔡力力

解放軍總醫院，北京 100853 1南樓心血管一科；2南樓臨床檢驗科

血脂代謝紊亂與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成密切相關，研究顯示，血脂持續異常是促進AS發生及發展的重要因素，但臨床中常常有部分患者既往存在血脂水平升高，但急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)發生時低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)反而處于較低水平，因此，粥樣斑塊的穩定性是否與血脂水平波動有關不得而知。該研究通過制造血脂波動模型，觀察血脂水平顯著波動與斑塊穩定性之間的關系，進一步探討血脂異常影響動脈粥樣斑塊的方式及機制。

材料與方法

1 試劑及儀器 高脂、低脂及普通飼料(北京市科傲公司)，血脂及ELISA試劑盒(羅氏公司)；Thermo IEC CL40離心機(公司)，全自動生化分析儀(Roche Hitachi917型(公司)，瑞典產LKB-Ⅲ型超薄切片機，OLYMPUS BX60型雙目顯微鏡。西門子公司SEQUOIA512型超聲儀，探頭頻率8~14 MHz。

2 實驗動物與分組 24只12周齡的健康雄性新西蘭大耳兔，體質量2.0~2.5 kg，由本院實驗動物中心提供(許可證編號：SCXK(京)2007-0003)，環境適應飼養1周后隨機分為3組：空白組(A)6只，飼普通料；對照組(B)9只，持續以含1%膽固醇、3%豬油的高脂飼料飼養；血脂波動組(C)9只，高脂飼料飼養至12周動脈粥樣硬化模型成功建立后，與低脂飼料每隔3周交替喂養1次，即12周換低脂飼料、15周換高脂飼料、18周換低脂飼料、21周換高脂飼料[1]。3組動物飼料120 g/d，自由飲水，共喂養24周。實驗過程中因腹瀉及不明原因死亡4只，剩余20只納入有效樣本統計分析。

3 血清生化檢測及主動脈超聲檢測 A、B兩組于0、12、24周末、C組于0、12、15、18、21、24周末經兔耳緣靜脈空腹采血，血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、LDL-C檢測采用羅氏公司試劑在本院生化室用免疫比濁法完成，ELISA法測血清超敏C反應蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)水平。根據血脂原始參數計算血脂平穩度，以血脂平穩指數(smoothness index，SI)表示，SI=-x/s(-x與s分別指12~24周5次采血各血脂水平的均值與標準差)，SI值越高說明血脂平穩度越好，反之則說明血脂水平波動大。應用超聲儀于實驗開始、12周末及24周末行腹主動脈超聲檢測。

4 病理形態學觀察 24周末處死動物，取主動脈剝離外膜脂肪組織，縱行剖開置于多聚甲醛中固定保存。大體標本行油紅染色后攝像，利用生物醫學圖像分析系統(Image-pro plus)測定斑塊面積和內膜面積，計算斑塊與內膜面積百分比。于主動脈弓處取材，常規石蠟包埋，制成厚約5 μm橫截面切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察超微結構。

5 數據處理 結果計算均采用-x±s表示，數據統計采用SPSS13.0軟件分析。計量資料采用t檢驗和方差分析。

結 果

1 實驗動物一般情況 實驗過程中A組不明原因死亡2只，B、C組因腹瀉各死亡1只，最終剩余20只動物資料納入統計學分析。喂養24周后，各組動物體重均較喂養前顯著增加(P＜0.01)，24周體重明顯大于12周(A組P＜0.05，余P＜0.01)，但各組之間比較無統計學差異(P＞0.05)，見表1。

2 血脂參數、SI及血清hs-CRP變化 C組通過交替高低脂飼料，成功制作高低血脂波動模型(圖1)。12周時，B組和C組動物血清TC、LDL-C、hs-CRP水平均較0周及A組明顯升高，HDL-C則較0周及A組顯著降低(P＜0.01)；24周時，C組血清TC、LDL-C水平明顯低于B組(P＜0.05)，血清hs-CRP水平明顯高于12周水平及B組(P＜0.01)。24周時，B、C組SI均低于A組，C組TC與LDL-C SI值低于B組的12.51，見表1。

表1 三組體重、SI、血脂及hs-CRP比較Tab. 1 Weight, SI and serum lipid and hs-CRP level in 3 groups

圖 1 C組不同周數血脂水平Fig. 1 Lipid level in group C at different weeks

3 主動脈超聲 造模前3組兔腹主動脈均內壁光滑，內膜不易顯示，管壁無隆起、增厚、斑塊形成。高脂喂養后，動脈管壁表現內-中膜厚度(intima-media thickness，IMT)增厚，局部隆起甚至多發斑塊形成。0周時，各組動物主動脈IMT無統計學差異，飼養12周后，B、C組IMT明顯高于0周及空白對照組(P＜0.01)，且兩組血管內可見明顯斑塊形成；24周時，C組IMT明顯高于其12周值(P＜0.05)，且高于B組(P＜0.01)，見表2。另外，同一血管部位斑塊不同周數比較，12周時B組斑塊(0.74×3.46) mm、C組(0.80×4.9) mm，24周時B組(0.75×4.34) mm、C組(1.40×9.90) mm，可見C組斑塊增長速度明顯大于B組。

表2 三組不同周數IMT比較Tab.2 IMT in 3 groups at different weeks(mm)

圖 2 主動脈粥樣硬化病變血管內膜油紅染色Fig. 2 Oil red staining of atherosclerotic intima

圖 3 三組動脈粥樣斑塊HE切片比較Fig. 3 HE staining of atherosclerotic plaque sections from 3 groups A: normal intima in group A(×200); B：structure of atherosclerostic plaque in group B (×100); C：structure of atherosclerostic plaque in group C (×200); D：revas-cularization in group C(×400)

4 動脈粥樣硬化斑塊面積百分比 血管內膜油紅染色顯示，動脈粥樣硬化病變處被染成紅色(圖2)。C組斑塊面積百分比為(53.53±22.6)%，明顯較B組(33.90±24.91)%高(P＜0.05)。肉眼下可見A組主動脈內膜光滑，未被油紅著色，未見粥樣硬化斑塊；B組主動脈內膜有較嚴重的粥樣硬化病變，可見脂樣物質突出管腔，呈點、斑、條狀隆起，邊緣清楚，表面無明顯破潰，較嚴重者斑塊融合成片，以主動脈起始部為重；C組主動脈內膜有嚴重粥樣斑塊病變，密布內膜面，主動脈起始部嚴重，與B組相比斑塊邊緣不清楚，可見斑塊表面不光滑表現，降主動脈病變較B組重。

5 HE染色切片 A組主動脈內膜光滑平整，可見排列整齊的內皮細胞，內膜未見泡沫細胞及脂質沉積；B組動脈可見明顯動脈粥樣硬化斑塊，血管內膜明顯增厚，內皮細胞脫落，管壁內見泡沫細胞形成，內膜下及斑塊內有膽固醇結晶體形成，部分區域可見壞死及鈣鹽沉積；C組亦可見明顯粥樣斑塊形成，與B組相比，斑塊較厚但纖維帽較薄、脂核較大，部分斑塊可見纖維帽被溶解征象，管壁內可見大量泡沫細胞及炎性細胞，斑塊內可見新生血管形成(圖3)。顯微鏡下主動脈弓處斑塊及纖維帽厚度比較，C組斑塊厚度(800.38±98.25) μm明顯大于B組(675.00±109.67) μm(P＜0.05)，但纖維帽厚度(103.50±45.66) μm小于B組(295.83±97.90) μm(P＜0.01)。

討 論

ACS的主要病理機制是不穩定的動脈粥樣硬化斑塊破裂及血栓形成，因此發現影響斑塊進展速度的因素及預測動脈粥樣斑塊的穩定性具有十分重要的臨床指導意義。影響穩定斑塊進展為易損斑塊的相關因素主要包括斑塊自身結構即“大脂核”特征薄纖維帽、血管內皮功能異常、高膽固醇血癥以及炎癥反應等[2-5]；且發現血清標記物如MMP-9、IL-18等可以預測易損斑塊[6-7]。眾所周知導致動脈粥樣硬化斑塊的罪魁禍首是高水平的LDL-C，其通過氧化修飾成為ox-LDL，ox-LDL在動脈斑塊的早期形成和后期進展中均發揮重要生物學效應，包括損傷血管內皮細胞、表達黏附分子、聚集白細胞以及形成泡沫細胞，其增加可導致粥樣斑塊由穩定向不穩定的易損斑塊轉化[8]。然而臨床工作中，部分ACS患者發病時卻表現出較低水平的LDL-C，由此推測血脂平穩度在斑塊的進展中可能起到一定的作用。

本研究結果顯示：血脂波動組TC、LDL-C的SI值分別為3.60、3.29，明顯低于對照組的12.51、7.61。飼養12周后，與空白組及基礎值相比，對照組和血脂波動組血清TC、TG、LDL-C及hs-CRP水平顯著升高，差異有統計學意義；24周后，與對照組相比，血脂波動組hs-CRP水平明顯升高。血脂波動組不同周數腹主動脈超聲示血管內中膜厚度明顯高于對照組，超聲下24周與12周斑塊大小比較可見血脂波動組進展速度較對照組快。主動脈形態學變化方面，對照組及血脂波動組主動脈內壁肉眼及光鏡下均可見典型動脈粥樣斑塊，血脂波動組斑塊面積百分比較對照組升高，但斑塊纖維帽厚度較對照組薄(肩部明顯)。另外，血脂波動組斑塊纖維帽周圍有大量炎性細胞浸潤，部分區域可見新生血管及明顯纖維帽不連續現象。本研究結果證實，血脂平穩度對動脈粥樣硬化斑塊的進展速度有所影響，且SI越小即血脂波動越大，斑塊的發展速度越快。原因可能為炎癥反應貫穿動脈粥樣硬化斑塊發生和進展的全過程，既往亦有文獻證實hs-CRP與動脈粥樣硬化斑塊進展明顯相關[9-11]。而本研究中血脂波動組hs-CRP水平較高，且切片中可見大量炎性細胞浸潤，可推測不平穩的血脂水平造成斑塊內炎癥反應增加，而加劇的炎癥反應導致動脈斑塊進展速度加快。但是血脂水平波動究竟是通過何種機制導致血管內炎癥反應增加，仍需進一步研究。

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