八號膏對大鼠深II度燙傷模型創面的治療作用及其機制研究

蘇 涌， 許杜娟，*， 高昌琨， 何家樂， 高 建，*， 宋禮華

(1.安徽醫科大學藥學院，安徽合肥 230032;2.安徽醫科大學第一附屬醫院藥學部，國家中醫藥管理局中藥化學三級實驗室TCM-2009-202，安徽合肥230022;3.安徽安科生物工程 (集團)股份有限公司，安徽合肥 230032)

安徽醫科大學第一附屬醫院上世紀70年代開發研制的八號燒傷膏是由大黃、五倍子、地榆、冰片等組成的中藥復方制劑，其療效經臨床反復驗證，對各種原因引起的燒傷，燙傷有良好的治療效果。八號膏目前仍是燒傷科在臨床治療各種燒傷中的主要藥物，但其作用機制不明，限制其進一步的開發使用。

現有的研究發現八號膏的主藥中大黃、地榆均有明顯的抗炎抗氧化作用［1-3］，由此推測八號膏可能通過抗炎抗氧化作用保護燙傷創面。本研究通過建立大鼠深II度燙傷模型，從抗炎抗氧化的角度闡明其保護作用，為八號膏治療燙傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 八號膏 (由安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科制備，批號20120110。處方組成為大黃、地榆、五倍子、爐甘石、赤石子、黃蠟、麻油、冰片。臨床用藥量設為高劑量，含生藥0.29 g/g;高劑量經熟麻油稀釋一倍設為低劑量，含生藥0.14 g/g);濕潤燒傷膏 (由北京光明中醫燒傷創瘍研究所、汕頭經濟特區美寶制藥廠生產，國藥準字0000004，批號1704103A);谷胱甘肽(GSH)測試盒 (南京建成生物工程研究所，批號20120324);黃嘌呤氧化酶 (XOD)測試盒 (南京建成生物工程研究所，批號20120322);白介素1β(IL-1β)檢測試劑盒 (上海源葉生物科技有限公司，批號10634R)。

1.1.2 儀器與設備 電子天平 (FA2104，上海天平儀器廠);托盤天平 (WSZ-90-74，北京醫用天平廠);數顯恒溫水浴鍋 (江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠);Uquant全波長酶標儀 (美國 biotek公司)。

1.1.3 動物 SD大鼠，76只，雌雄各半，體質量250～300 g，由安徽醫科大學動物中心提供。單籠飼養，自由攝食飲水。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與設計 76只SD大鼠，雌雄各半，體質量250～300 g，隨機分成八號膏高劑量組、八號膏低劑量組、濕潤燒傷膏組、模型組、正常組。正常組12只，其余各組16只。根據燙傷后創面愈合的兩個不同時期，分別于傷后3 d和14 d獲取創面皮膚和血清標本，每個時間點8只，正常組6只。

1.2.2 深Ⅱ度燒傷模型的建立 燙傷前1 d，大鼠背部以10%硫化鈉脫毛，清水洗凈，擦干。實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。自制直徑1 cm，長25 cm鐵棒，一端光滑，做為燙傷面。實驗時腹腔注射10%水合氯醛 (0.3 mL/100 g)麻醉大鼠。鐵棒預先置于沸水中30 min，取出后迅速擦干無外界壓力下置于大鼠背部，持續15 s，腹腔注射5 mL生理鹽水抗休克。燙傷后創面蒼白、腫脹，病理證實為深Ⅱ度燙傷。正常組鐵棒置于25℃水中，其余條件不變。

1.2.3 給藥 術后八號膏高、低劑量組和濕潤燒傷膏組創面分別涂抹高、低劑量八號膏及濕潤燒傷膏，高劑量組每次給藥約含生藥0.18 g，低劑量組每次給藥約含生藥0.09 g。大鼠單籠飼養，自由進食飲水。濕潤燒傷膏每日換藥2次，八號膏每日換藥1次，每次換藥前新潔爾滅清洗殘藥，消毒，正常組與模型組只用新潔爾滅消毒。

1.2.4 創面含水量測定 燙傷后分別于3、14 d處死大鼠，以干濕質量法測定創面含水量:剪取約100 mg創面，稱定質量記為W1，隨后80℃烘箱內干燥48 h，稱定質量記為W2，按以下公式計算創面含水量，含水量 =(W1－W2)/W1×100%。

1.2.5 創面生化指標測定 燙傷后3、14 d取創面組織，按質量體積比1∶9加入預冷生理鹽水制成10%勻漿，3 000 r/min離心10 min取上清，按試劑盒要求檢測谷胱甘肽含有量及XOD活力。

1.2.6 IL-1β測定 燙傷后3 d后股動脈取血，3 000 r/min離心10 min取上清，按試劑盒要求檢測IL-1β水平。

1.3 統計學處理

各組數據采用表示，SPSS 11.0軟件進行方差分析。采用LSD法統計組間差異性，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 八號膏對深II度大鼠燙傷后3、14 d含水量的影響 燙傷后3 d模型組創面含水量明顯升高，14 d后含水量有所降低，但仍高于正常組 (P＜0.05)。八號膏高、低劑量組各時間點創面含水量顯著低于模型組，但仍高于正常組 (P＜0.05)。八號膏高、低劑量與濕潤燒傷膏組間無明顯差異(P＞0.05)，見表1。

表1 八號膏對深II度大鼠燙傷創面含水量的影響(n=8，± s，%)Tab.1 Effect of Bahao Ointment on wound water content of deep partial-thickness burn rats(n=8，± s，%)

表1 八號膏對深II度大鼠燙傷創面含水量的影響(n=8，± s，%)Tab.1 Effect of Bahao Ointment on wound water content of deep partial-thickness burn rats(n=8，± s，%)

注:與正常組相比，*P＜0.05;與模型組相比，△P＜0.05。下同。

傷后時間組 別3 d 14 d正常組 62.92±4.3860.83 ±4.40模型組 74.20±1.43* 72.07±1.54*八號膏高劑量組 71.17±1.09＊△ 67.57±1.86＊△八號膏低劑量組 70.86±2.03＊△ 67.56±1.43＊△濕潤燒傷膏組 71.22±1.29＊△ 68.34±1.69＊△

2.2 八號膏對深Ⅱ度大鼠燙傷后3、14 d創面XOD活力的影響 燙傷后3 d創面XOD活力較正常組顯著上升，14 d后創面XOD活力下降，但仍高于正常組 (P＜0.05)。八號膏高、低劑量組各時間點XOD活力明顯低于模型組 (P＜0.05)，與正常組之間無顯著性差異 (P﹥0.05)，見表2。

表2 八號膏對深Ⅱ度大鼠燙傷創面XOD活力的影響(n=8，±s)Tab.2 Effect of Bahao Ointment on the wound XOD activity of deep partial-thickness burn rats(n=8，±s)

表2 八號膏對深Ⅱ度大鼠燙傷創面XOD活力的影響(n=8，±s)Tab.2 Effect of Bahao Ointment on the wound XOD activity of deep partial-thickness burn rats(n=8，±s)

組 別 XOD/(U·mgport－1)3 d 14 d正常組10.14 ±1.82 7.72 ±1.27模型組 20.08±2.71* 12.89±1.74*八號膏高劑量組 12.14±4.99△ 7.66±1.60△八號膏低劑量組 15.34±5.88△ 7.64+1.92△濕潤燒傷膏 12.31±3.92△ 8.30+1.82△

2.3 八號膏對深II度大鼠燙傷后3、14 d創面谷胱甘肽的影響 燙傷后3 d模型組創面谷胱甘肽含有量較正常組顯著降低，14 d后略有升高，但仍低于正常組 (P＜0.05)。八號膏高、低劑量組各時間點谷胱甘肽含有量明顯高于模型組，高劑量組各時間點谷胱甘肽含有量顯著高于正常組 (P＜0.05)，見表3。

表3 八號膏對深Ⅱ度大鼠燙傷創面谷胱甘肽影響(n=8，±s)Tab.3 Effect of Bahao Ointment on the wound GSH content of deep partial-thickness burn rats(n=8，±s)

表3 八號膏對深Ⅱ度大鼠燙傷創面谷胱甘肽影響(n=8，±s)Tab.3 Effect of Bahao Ointment on the wound GSH content of deep partial-thickness burn rats(n=8，±s)

組 別 谷胱甘肽/(mg·mgprot－1)3 d 14 d正常組13.12 ±0.90 13.82 ±0.82模型組 6.21±1.55* 7.55±0.69*八號膏高劑量組 16.19±1.49＊△ 18.33±2.96△八號膏低劑量組 8.57±2.34△ 13.48±2.14△濕潤燒傷膏 10.46±3.18△ 13.44±2.41△

2.4 八號膏對深Ⅱ度燙傷后3d大鼠血清IL-1β水平的影響 燙傷后3 d模型組血清IL-1β水平較正常組顯著上升，八號膏高、低劑量組濕潤燒傷膏組IL-1β則明顯低于模型組 (P＜0.05)，見表4。

表4 八號膏對深Ⅱ度大鼠燙傷血清IL-1β影響(n=8，±s)Tab.4 Effect of Bahao Ointment on the serum IL-1β content of deep partial-thickness burn rats(n=8，±s)

表4 八號膏對深Ⅱ度大鼠燙傷血清IL-1β影響(n=8，±s)Tab.4 Effect of Bahao Ointment on the serum IL-1β content of deep partial-thickness burn rats(n=8，±s)

組 別 IL-1β/(pg·mL－1)正常組3.27 ±0.77模型組 7.24±1.31*八號膏高劑量組 4.43±0.37△八號膏低劑量組 4.61±0.58△濕潤燒傷膏 4.99±1.10△

3 討論

八號膏是由大黃、五倍子、地榆、冰片等組成的特色中藥復方制劑，具有清熱解毒、活血化瘀、澀經止血、生肌斂瘡之功效，臨床上適用于各種燒燙傷的治療。小面積深Ⅱ度度燙傷為臨床最為常見的燒傷類型，臨床上應用八號膏治療此種類型的燙傷能有效減少創面滲出，加速創面的愈合，療效顯著。因此本研究選擇建立小面積深Ⅱ度大鼠燙傷模型來探討八號膏作用機制。同時深Ⅱ度燙傷后創面愈合主要分為兩個時期:炎癥反應期 (2～4 d)和增殖修復期 (3～20 d)［4］。為了從不同時期研究八號膏對深Ⅱ度燙傷創面的治療作用，結合文獻選取了3 d和14 d作為研究時間點［4-5］。

中醫理論認為燒燙傷是火毒所致。機體受熱力襲擊而致肌膚經絡損傷，引起氣滯血瘀、津液輸布失常，進而出現肌膚紅腫熱痛和滲出腫脹。這與現代醫學對燒傷后炎癥反應和創面微循環障礙的認識相一致。皮膚燙傷后大量炎性細胞浸潤創面，炎性細胞分泌大量炎性因子，致使創面發生過度的炎癥反應。適度的炎癥反應有利于清除創面感染，刺激血管再生，但過度的炎癥反應是造成組織細胞壞死的主要因素，是創面早期加深擴大的主要原因之一［6］。同時有報道指出過度的炎癥反應可以激活基質金屬蛋白酶 (MMPs)，進而加速細胞外基質的降解，阻礙創面的愈合。因此抑制過度的炎癥反應能保護創面，促進愈合［7］。

IL-1β主要由激活的單核巨噬細胞和肥大細胞分泌。它能誘導炎性細胞分泌多種炎性因子、趨化因子，急性期蛋白等，進而激活炎癥反應，是炎性因子瀑布性釋放的核心因子。燒傷后抑制IL-1β能明顯減輕局部和全身炎癥反應，促進創面的愈合［8］。本實驗證實燙傷后3 d模型組血清IL-1β仍高于正常水平，八號膏治療組IL-1β明顯降低。

燒傷后，局部創面微循環障礙，創面滲出增多，組織灌流量不足，處于缺血缺氧的狀態。黃嘌呤脫氫酶轉化為 XOD，進而產生大量的 O2－和H2O2，是燒傷后活性氧 (ROS)的主要來源。另一方面燒傷后機體抗氧化能力下降，抗氧化物質如谷胱甘肽耗竭，最終導致氧化平衡失調，氧化應激發生。ROS可以引起脂質過氧化反應，直接損傷細胞膜，導致膜功能障礙;細胞內的ROS可以直接引起DNA斷裂，造成細胞死亡;ROS可以促進TNF-α，IL-1β等多種炎性因子釋放，加重炎癥反應;ROS抑制角化細胞、成纖維細胞的遷移和增殖，不利于細胞外基質的合成;同時增強中性粒細胞和巨噬細胞的趨化性［9-11］。研究表明使用抗氧制劑如維生素E，維生素C等可以顯著地促進創面愈合［12］。因此，燒傷后盡早進行抗氧化治療可以更好地促進創面愈合。本實驗結果顯示，燒傷后3 d創面XOD的活力顯著提高，14 d逐漸恢復。八號膏組XOD活力低于模型組，且兩者之間有統計學差異。說明八號膏可以抑制燒傷后XOD的激活，降低XOD的活力，從而減少創面的ROS的產生。谷胱甘肽是保護蛋白中巰基和其他親核基團免受ROS影響所必須的抗氧化物質［13-14］。谷胱甘肽的濃度是反應創面損傷程度的關鍵指標之一［15］。實驗中發現燒傷后3 d模型組谷胱甘肽含有量顯著降低，14 d逐漸恢復。而八號膏則可以逆轉谷胱甘肽的降低，高劑量組谷胱甘肽含有量甚至高于正常組。

八號膏可以降低創面含水量、XOD活力，增加創面谷胱甘肽的含有量，同時降低血清炎性因子IL-1β的水平，提示八號膏可能通過抗炎抗氧化作用保護燙傷創面。

［1］呂慧英，梁逸曾，趙晨曦.大黃提取物抗氧化活性與化學成分相關性研究［J］.中南大學學報，2009，11(2):4-5.

［2］魏智蕓，滕建文，黃 麗，等.地榆提取物抗氧化與抗過敏作用研究［J］.時珍國醫國藥，2009，20(8):1958-1960.

［3］聶淑琴.地榆提取物對老化加速小鼠抗氧化保護能力的影響［J］.國外醫學:中醫中藥分冊，2001，23(2):89-90.

［4］Turtay M G，Firat C，Samdanci E，et al.Effects of montelukast on burn wound healing in a rat model［J］.Clin Invest Med，2010，33(6):413-421.

［5］Huseini H F，et al.Evaluation of wound healing activities of kefir products［J］.Burns，2012，38(5):719-723.

［6］Guo S，Dipietro L A.Factors affecting wound healing［J］.J Dent Res，2010，89(3):219-229.

［7］Keck M，Herndon D H，Kamolz L P，et al.Pathophysiology of burns［J］.Wmw Wiener Medizinische Wochenschrift，2009，159(13-14):327-336.

［8］蘇 宇，周蘭蘭，朱文靖.復方燙傷膏對大鼠深II度燙傷模型的保護作用及機制研究［J］.中國中藥雜志，2012，37(14):2143-2146

［9］Barua C C，Talukdar A，Begum S A，et al.In vivowound-healing efficacy and antioxidant activity ofAchyranthes asperain experimental burns［J］.Pharm Biol，2012，50(7):892-899.

［10］楊國志，王潤秀，林 源.氧化應激與創面愈合［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(2):355-358.

［11］Parihar A，Parihar U S，Milner S，et al.Oxidative stress and anti-oxidative mobilization in burn injury［J］.Burns，2008，34(1):6-17，

［12］Barbosa E，Faintuch J，Machado Moreira E A，et al.Supplementation of vitamin E，vitamin C，and zinc attenuates oxidative stress in burned children:a randomized，double-blind，placebo-controlled pilot study［J］.J Burn Care Res，2009，30(5):859-866.

［13］Toklu H Z，Sener G，Jahovic N，et al.beta-glucan protects against burn-induced oxidative organ damage in rats［J］.Int Immunopharmacol，2006，6(2):156-69.

［14］Wan K C，Wu H J，Chan H P，et al.Effects of antioxidants on pyridinoline cross-link formation in culture supernatants of fibroblasts from normal skin and hypertrophic scars［J］.Clin Exp Dermatol，2002，27(6):507-512.

［15］Zhong X F，Huang G D，Luo T，et al.Protective effect of rhein against oxidative stress-related endothelial cell injury［J］.Mol Med Report，2012，5(5):1261-1266.