宣肺化痰活血法對哮喘大鼠氣道重塑及TGF－β1／Smad信號通路的影響＊

林曉冰 劉小虹 許麗梅 單麗囡 陳文桂 劉 瓊 廣州中醫藥大學（廣州 510006）

氣道重塑是氣道炎癥慢性化發展的必然結果，是哮喘的一個主要特征。由于氣道長期持續性的炎癥反復發作，反復修復，導致組織增生而發生重塑。其主要病理學改變包括基底膜（Basement Membrane，BM）增厚、膠原沉著、平滑肌細胞（Airway Smooth Muscle Cell，ASMC）增生／肥大、血管增生、粘液腺（Mucous Gland）增生等［1］。能夠導致氣道高反應性（Airway Hyperresponsiveness，AHR）和氣道狹窄。一般認為，氣道重塑在哮喘發病初期就已經開始，導致臨床表現復雜多樣，增加治療的難度。目前多項研究提示TGF－β1可能參與哮喘氣道重塑，Smads家族是TGF－β1下游信號通路的關鍵元件，TGF－β1對氣道重塑的生物學活性可以通過其下游蛋白Smads信號轉導途徑來實現。從祖國醫學角度來說，痰、瘀是哮喘氣道重塑中兩個重要的病理因素。本實驗借助哮喘氣道重塑模型，旨在探討宣肺化痰活血法對哮喘大鼠氣道重塑和TGF－β1／Smad信號通路的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 美國sigma公司進口分裝卵清蛋白（OVA）由北京索來寶科技有限公司提供，批號A2512；TGF－β1兔多抗、Smad3兔多抗、Smad7兔多抗、免疫組化試劑盒由北京博奧森生物技術有限公司提供；EasyScript First－Strand cDNA Synthesis SuperMix 、TransStart TM Green qPCR Super－Mix由北京全式金生物技術有限公司提供。魚躍402AI超聲霧化器醫用霧化器由江蘇魚躍醫療設備股份有限公司生產；LEICAEG1140H石蠟包埋機、LEICA RM2255全自動輪轉切片機由德國萊卡儀器有限公司生產；3K30型冷凍離心機由美國Sigma公司生產；Bio－RADiCycler實時熒光定量PCR儀由美國bio－rad公司生產。

1.2 實驗動物與分組 6周齡SPF級SD大鼠72只，體重150±20g，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供。適應喂養1周后，隨機分為A組（空白組）、B組（模型組）、C組（中藥高劑量組）、D組（中藥中劑量組）、E組（中藥低劑量組）、F組（地塞米松組），每組12只。

1.3 藥物制備 宣肺化痰活血中藥組成：炙麻黃、射干、地龍、北杏仁、法半夏、桔梗、細辛、桃仁等藥物組成，加水煎煮，水浴濃縮成含生藥量4g／mL。對照藥物醋酸地塞米松片由廣東華南藥業集團有限公司提供，批號091004。

1.4 動物模型復制及給藥方法 除A組，其余各組參照文獻在第l、8天腹腔注射lmL OVA／AL（OH）3混合液（含OVA l0mg和AI（OH）3200mg）致敏，第15天開始應用超聲霧化器于自制簡易霧化箱中以一定濃度的OVA生理鹽水溶液霧化激發，每次20min，隔日1次，持續8周。激發濃度分別為第1、2周1%，第3、4周1.5%，第5、6周2%，第7、8周2.5%［2］。C、D、E組于第15天開始每次霧化前0.5h按40g／kg、20g／kg、10g／kg劑量給與中藥灌胃。F組則于第15天開始每次霧化前0.5h給予0.5mg／kg地塞米松灌胃。A組不造模，給予等量生理鹽水代替藥物。

1.5 取材及檢測方法 末次給藥后2h，用10%水合氯醛350mg／kg腹腔注射麻醉，腹主動脈抽血后處死，開胸結扎，迅速取左肺中葉組織塊置于凍存管中－80℃凍存，用于RNA抽提；取出右肺，用4%多聚甲醛灌注及固定，石蠟包埋，用于HE染色及免疫組化檢查。

1.5.1 大鼠肺組織：HE染色評定肺組織病理形態學改變：將固定好的大鼠右肺組織切成0.2cm厚的組織塊，常規脫水、透明，石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm，行HE染色，經烘片、脫蠟、染色、脫水、封固后，將肺組織標本切片在光學顯微鏡放大100倍下找到完整的細支氣管橫斷面，每張切片選取3支，采用圖像采集軟件采集圖像，評定肺組織病理形態學改變。再用圖像分析軟件測量分析，分別測算支氣管內管壁（橫斷面）面積（WAi）、平滑肌（橫斷面）面積（WAm）、基底膜周長（Pbm），用基底膜周長對測定的內管壁面積和平滑肌面積測量值進行標準化，得出WAi／Pbm和WAm／Pbm，此數值可以一定程度反映內管壁和平滑肌厚度的變化。

1.5.2 免疫組化法檢測肺組織 TGF－β1、Smad3、Smad7蛋白表達。將固定好的大鼠右肺組織切成0.2cm厚的組織塊，常規脫水、透明，石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm，常規脫蠟、水化，進行免疫組化染色。滴加一抗、4℃過夜，滴加生物素化二抗、鏈霉素化親和素試劑、DAB顯色、脫水、透明、封片、鏡檢。用PBS代替一抗作為陰性對照。每一標本取1張切片，每張切片隨機取3個視野，用圖像分析系統檢測各指標PU值。

1.5.3 熒光定量PCR檢測 TGF－β1、Smad3、Smad7mRNA相對表達。將50mg肺組織放入EP管中冰上剪碎，加入1mL TransZol試劑用電動勻漿器中對組織進行勻漿裂解，經分離、沉淀、洗滌、溶解等步驟將提取的總RNA保存于－80℃。每例RNA溶液各取0.5μL稀釋250倍后測定提取的RNA樣品在波長260nm和280nm處的OD值，各組隨機挑選6個OD值介于1.6－1.8樣品進行逆轉錄。隨后將得到的cDNA進行PCR擴增。所用引物：TGF－β1上游引物序列（5’→3’）TGAGTGGCTGTCTTTTGACG，下游引物序列 （5’→ 3’）ACTTCCAACCCAGGTCCTTC，產物大小350bp［3］；Smad3上游引物序列（5’→3’）CAGGGCTTTGAGGCTGTCTA，下游引物序列（5’→ 3’）CTGGCATCTTCTGTGGTTTC，產物大小357 bp；Smad7上游引物序列（5’→3’）CAGGGCTTTGAGGCTGTCTA，下游引物序列（5’→ 3’）CTGGCATCTTCTGTGGTTTC，產物大小256bp［4］；Actb上游引物序列（5’→ 3’）GACCTTCAACACCCCAGC，下游引物序列（5’→3’）ACGCACGATTTCCCTCTC，產 物 大 小 256bp［5］。 反 應 條 件 為：95℃預變性2min；95℃變性20sec，55℃退火25sec，72℃延伸30sec進行40cycles。β－actin擴增作為參照。采用qRT－PCR法計算各組中目的mRNA的相對表達量，PCR表達結果用2－▲CT進行統計分析。

1.6 統計方法 數據用stata10.0分析軟件進行統計分析，計量資料用表示，當方差齊性時各組處理效應差異用單因素方差分析，組間兩兩比較用scheffe法；當方差不齊時用Kruskal－Wallis檢驗，組間兩兩比較用Nemenyi法，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果及分析

2.1 大鼠肺組織氣道學改變 B組氣道上皮細胞脫落，杯狀細胞增多氣道粘膜水腫明顯，氣道粘膜層、粘膜下層以及血管周圍組織可見有大量的炎性細胞浸潤，以漿細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞為主。氣道管腔縮小，甚至完全閉塞，氣道腔內可見大量粘液，氣管平滑肌增厚，個別肺泡出現融合現象。C、D、E、F組明顯減輕，氣道上皮不完整，氣道粘膜輕度水腫，氣道粘膜層、粘膜下層以及血管周圍組織可見有少量的炎性細胞浸潤，部分氣道管腔縮小，氣道腔內可見少量粘液，氣管平滑肌輕度增厚（圖1）。圖像分析結果顯示，與A組相比，B組WAm／Pbm、WAi／Pbm明顯增加（P＜0.01）；與B組相比，C、D、E、F組明顯減小（P＜0.01）（表1）。

表1 肺組織形態學比較

2.2 肺組織 TGF－β1、Smadm3、Smad7蛋白表達 免疫組化結果顯示，A組TGF－β1、Smad3在肺組織氣道周圍少量的陽性著色；與A組相比，B組表達明顯增強（P＜0.01），主要表達于胞質，主要分布于氣道上皮；與B組相比，C、D、F組表達明顯減輕（P＜0.01）。A組Smad7蛋白在肺組織氣道壁周圍有較多陽性著色；與A組相比，B組表達明顯減弱（P＜0.01）；與B組相比，C、D、E、F表達明顯增強（P＜0.01）（表2）。

2.3 肺組織 TGF－β1、Smad3、Smad7mRNA 相對表達與B組相比，C、F組TGF－β1相對表達量都明顯下調（P＜0.01），D組也有所下調（P＜0.05），E組雖有所下調，但無統計學意義（P＞0.05）（圖2－a）。與B組相比，C、E 組Smad3表達明顯下調（P＜0.01），D組也有所下調（P＜0.05），F組雖有所下調，但無統計學意義（P＞0.05）（圖2－b）。與B組相比，C、D組Smad7表達有所上調（P＜0.05），E、F組雖有所上調，但無統計學意義（P＞0.05）（圖2－c）。×100

表2 大鼠肺組織TGF－β1、Smad3、Smad7蛋白表達比較（PU值）（）

表2 大鼠肺組織TGF－β1、Smad3、Smad7蛋白表達比較（PU值）（）

注：與A組相比，▲P＜0.01。與B組相比，▲P＜0.01，◇P＜0.05

圖1 大鼠肺組織病理形態學比較（HE染色 ）

圖2 大鼠肺組織 TGF－β1、Smad3、Smad7mRNA 表達比較

3 討 論 哮喘發生時，氣道壁的各個組分都會出現異常改變包括上皮細胞脫落、平滑肌肥大和增生、粘膜下膠原纖維沉積導致的基質成分增加、粘液腺增生肥大、新血管增生等，這些都可以導致氣道壁面積的增大。祖國醫學認為，各種慢性炎癥反應導致的組織增生，屬于痰、瘀范疇。哮喘氣道厚度的改變（氣道平滑肌增生、粘液腺增生、膠原沉著、基底膜增厚）屬于中醫無形之痰和血瘀相兼為病范疇。痰與瘀屬于人體常見的病理產物，常常相兼為病，互相影響。究其原因，痰瘀同屬陰津為病的不同表現。祖國醫學認為，津血同源。津和血均源于飲食水谷精微，同屬人體的陰液。二者在生理上互相轉化，互相作用，參與體液調節，在病理上亦互相影響。故《景岳全書》云：“津凝血敗，皆化為痰”。現代研究亦發現，支氣管哮喘病人急性發作期全血粘度（高、中、低切變率）、血漿粘度、紅細胞聚集指數均明顯高于緩解期與對照組。哮喘緩解期血漿粘度、RAI恢復至接近正常對照組水平，但各切變率下的全血粘度仍高于正常對照組（P＜0.05）。表明支氣管哮喘病人急性發作期和緩解期存在不同程度的高粘滯血癥［6］。宣肺化痰活血中藥是在射干麻黃湯基礎上加減而成，前期的研究發現能夠改善哮喘的癥狀，能調節免疫、拮抗炎性介質、能夠減少過敏性哮喘豚鼠電鏡下肺部膠原纖維，改善毛細血管增厚的基底膜［7－11］。該方著眼于伏藏于肺絡的痰和瘀，運用射干、椒目降氣平喘，麻黃、細辛辛溫解表散寒，宣泄肺之郁氣，再加上半夏、桔梗等祛痰，地龍、桃仁活血通絡。諸藥合用，直達病所，達到改善氣道重塑的目的。

TGF－β家族包括數種異構體，是細胞增殖、分化、細胞外基質合成和凋亡的主要調節者之一。巨噬細胞、上皮細胞、成纖維細胞和嗜酸性粒細胞都能夠產生TGF－β1。TGF－β1是目前發現的刺激細胞外基質沉積活性最強的細胞因子。活化的TGF－β1能使Smad2／3磷酸化，并進入細胞核，調控相應的基因表達，重組細胞骨架成分，誘導其向肌成纖維細胞轉化。肌成纖維細胞具有平滑肌和纖維細胞兩種特性，能合成、分泌細胞外基質成分，特別是膠原纖維，是細胞外基質增厚的重要原因。研究發現，相對于正常人，中重度哮喘患者TGF－β1mRNA表達增加，且其表達量和上皮下纖維化直接相關［12－13］。在哮喘患者的氣道中，平滑肌細胞分泌大量的 TGF－β1，分泌出的 TGF－β1反過來又促進平滑肌細胞和杯狀細胞增生肥大，增加膠原和纖維連接蛋白合成，并促進其在細胞外基質沉積，導致管腔狹窄和不可逆的肺功能改變。TGF－β1能夠通過減少MMPs的表達、促進PAI－1和TIMPs的合成來減少ECM的降解。還可以通過刺激ECM受體的合成，使整合素的合成增加而影響ECM的產生。

Smad蛋白為TGF－β1信號通路的下游信號關鍵傳導分子，可將信號從胞膜直接傳至胞核，介導TGF－β1胞內信號傳導。Smad3是R－Smad蛋白家族成員，具有通路特異性；Smad7是ISmads蛋白家族成員，能抑制R－Smad的信號傳遞。Smad2和Smad3直接被TGF－βRI磷酸化，使得構象發生改變從而從受體復合物中釋放出來。Smad7能通過與絲氨酸／蘇氨酸激酶受體相 關 蛋 白 （serine－thre－onine kinase receptor－associated protein，STRAP）作用，與R Smads競爭TβRI，啟動抑制功能。研究發現，在健康肺組織中幾乎不能檢測到Smad3表達，而在哮喘小鼠組Smad3表達水平顯著上調［14］。Smad7與活化的TGF－β1I型受體結合就會阻止Smad2與I型受體結合和磷酸化，從而抑制TGF－β1信號傳導，在哮喘機體起到拮抗氣道重塑的作用［15］。

本研究通過免疫組化法和qRT－PCR方法檢測肺組織TGF－β1、Smad3、Smad7的蛋白和 mRNA 的表達，結果發現，蛋白和基因表達兩個側面都顯示B組大鼠肺組織TGF－β1、受體調節型蛋白Smad3表達水平均較A組大鼠明顯升高（P＜0.01），抑制轉錄型蛋白Smad7的蛋白表達有所減少（但P＞0.05），說明哮喘氣道重塑大鼠肺組織中TGF－β1／Smad信號通路處于激活狀態，從而使膠原纖維合成增加，導致ECM進行性積聚。哮喘Smad7mRNA水平應該表達明顯減少，此次雖然沒有能夠發現Smad7減少的表達與A組相比有統計學意義，但因為多組資料的非參數檢驗的兩兩比較方法比較保守，因此，B組中Smad7mRNA水平升高仍然值得關注。

與B組相比，C、D組TGF－β1、Smad3的蛋白和 mRNA的表達都明顯減少（p＜0.05），C、D組Smad7的蛋白和mRNA的表達明顯增加（p＜0.05），表明宣肺化痰活血法對 TGF－β1／Smad信號通路有抑制作用，其作用靶點可能是通過直接下調TGF－β1、Smad3的表達，同時也可能通過大量表達Smad7，從而與RSmads競爭TβR1，減少Smad3／Smad4異聚體的形成，抑制對TGF－β1在胞漿內的信號轉導，減少膠原纖維沉著和氣道上皮纖維化，從而改善氣道重塑。

綜上所述，宣肺化痰活血法可改善哮喘大鼠氣道重塑，其機制可能與通過調節TGF－β1／Smad信號通路有關。

［1］Bousquet J，Jeffery PK，Busse WW，et al.Asthma：From bronchoconstriction to airways inflammation and remodeling［J］.Am.J.Respir.Crit Care Med，2000，161：1720－45.

［2］吳銀跟，王麗新.基質金屬蛋白酶及其抑制劑在哮喘氣道重塑中的作用及止喘膠囊的干預［J］.中西醫結合學報，2004，2（6）：435－439.

［3］龔作炯，宋仕玲，阮 鵬，等.血管緊張素轉換酶抑制劑對肝纖維化大鼠TGFb，TGFR II，Smad3，7表達的影響［J］.世界華人消化雜志，2004，12（5）：1132－1135.

［4］LIANG Tie－jun，YUAN Jun－hua，TAN Yan－rong，et al.Effect of ursodeoxycholic acid on TGF beta1／Smad signaling pathway in rat hepatic stellate cells［J］.Chinese Medical Journal，2009，122（10）：1209－1213.

［5］Li Rongping，Xi Yebin，Liu Xiuzhi，et al.Expression of IL－1α，IL－6，TGF－βFasL and ZNF265During Sertoli Cell Infection by Ureaplasma Urealyticum［J］.Cellular ＆ Molecular Immunology，2009，（3）：215－221.

［6］劉 軍，姒 惠，金桂玲.支氣管哮喘患者血液流變學指標分析［J］.中國血液流變學雜志，2004，2（2）：261－262.

［7］劉小虹，鐘亮環，單麗囡.射麻止喘方對哮喘急性發作期（寒哮）患者外周血IL－5、IL－8水平的影響［J］.新中醫，2006，8（8期）：46－47.

［8］王 鵬.射麻止喘方對哮喘急性發作期患者外周血Th1／Th2偏移的影響及臨床觀察［D］.廣州中醫藥大學，2005.

［9］黃真炎，楊冬娣，昊玲霓，等.加味射干麻黃湯對過敏性哮喘豚鼠肺超微結構變化的電鏡觀察［J］.中醫藥研究，1998，14（2）：27－28.

［10］劉 瓊，梁直英，陳芝喜，等.射麻止喘液對過敏性哮喘豚鼠的作用［J］，廣州中醫藥大學學報，2000，3（1）：24－26.

［11］劉小虹，廖慧麗，梁直英，等.射麻止喘液對哮喘模型大鼠環核苷酸變化的影響［J］.廣州中醫藥大學學報，2001（04）：339－341.

［12］Minshall EM，Leung DY，Martin RJ，et al.Eosinophil－associated TGF－Β1mRNA expression and airwaysfibrosis in bronchial asthma［J］.Am J Respir Cell MolBiol，17：326－333，1997.

［13］Ohno I，Nitta Y，Yamauchi K，et al.Transforming growth factorβ1（TGFβ1）gene expression by eosinophils in asthmatic airway inflammation.［J］Am J Respir Cell Mol Biol，15：404－409，1996.

［14］Rosendahl AD，Checchin TE，Fehniger P，et al.Sideras.2001.Activation of the TGF－beta／activin－Smad2 pathway during allergic airway inflammation［J］.Am.J.Respir.Cell Mol.Biol，25：60－68.

［15］Nakao A，Sagara H，Setoguchi Y，et al.Expression of Smad7in bronchial epithelial cells is inversely correlated to basement membrane thickness and airway hyperresponsiveness in patients with asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2002，110（6）：873－8.