E3泛素連接酶HECTD3真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

盧敏瑩 楊波

·實(shí)驗(yàn)研究·

E3泛素連接酶HECTD3真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

盧敏瑩 楊波

目的 克隆E3泛素連接酶 (homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3, HECTD3) 基因及構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。方法 提取人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞RNA, 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以此作為模板PCR法擴(kuò)增HECTD3基因, 將其克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+), 測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒中包含HECTD3基因。結(jié)論 HECTD3基因克隆及真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功, 可以用于后續(xù)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)研究。

E3泛素連接酶；卵巢癌；真核表達(dá)質(zhì)粒

泛素化是一種蛋白質(zhì)的翻譯后修飾, 參與調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程, 其系統(tǒng)功能的紊亂與癌癥發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)［1］。HECTD3 (homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3)是一個(gè)功能目前尚未闡述清楚的新的E3泛素連接酶。有報(bào)道指出該基因可能在乳腺癌和宮頸癌中介導(dǎo)順鉑的化療耐受［2］, 但是目前尚未有人報(bào)道HECTD3在卵巢癌中的作用。且卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤, 僅2011年1年就導(dǎo)致全世界140000人死亡［3］。因此本文擬克隆HECTD3基因, 并構(gòu)建該基因真核表達(dá)質(zhì)粒,對(duì)進(jìn)一步研究HECTD3基因在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供有力的工具和手段。

1 實(shí)驗(yàn)材料

卵巢癌細(xì)胞SKOV-3、真核表達(dá)載體pCDNA3.1、大腸桿菌DH5α感受態(tài)由本室保存。RPMI-1640、胎牛血清、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。PrimeSTARHS DNA Polimerase with GC Buffer、EcoR I和Nhe I限制性外切酶購(gòu)自TaKaRa公司。Gel Extraction Kit購(gòu)自omega公司, DL2000、1Kb DNA Marker購(gòu)自天根生化科技有限公司。引物由invitrogen公司合成, 測(cè)序也由該公司完成。其余試劑購(gòu)自廣州威佳生物有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 HECTD3基因的擴(kuò)增 采用Trizol法提取SKOV-3細(xì)胞RNA, 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以該cDNA為模板進(jìn)行HECTD3基因的擴(kuò)增, Forward Primer： 5’-GGCgctagcATGGCGGGTCCTGGCCCGG-3’, Reverse Primer：5’-GGCgaattcTCACTCCTCC CAAGGGCTCATGTCA-3’, 其中小寫黑體的序列表示酶切位點(diǎn)。PCR結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。將擴(kuò)增的目的條帶用膠回收試劑盒回收, 具體操作見說(shuō)明書。

2.2 pcDNA-HECTD3重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶NheI和EcoRI, 37℃ 2 h消化真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和PCR擴(kuò)增得到的HECTD3基因片段, 回收載體和基因片段的酶切產(chǎn)物。T4 DNA Ligase 于16℃連接載體和基因片段。連接過(guò)夜后, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆送invitrogen公司測(cè)序。

3 結(jié)果

成功構(gòu)建HECTD3真核表達(dá)質(zhì)粒

從NCBI上得到HECTD3基因序列(gene bank number: NM_024602.5), 該基因開放閱讀框(open reading frame, ORF)全長(zhǎng)是2586 bp, 編碼861 aa。由圖1.A可以看出PCR反應(yīng)組在2500 bp左右有一條目標(biāo)條帶, 割膠回收該條帶, 將回收后的PCR條帶和pcDNA3.1(+) 載體用限制性酶消化, 圖1.B即為消化后的pcDNA3.1(+) 載體, 該載體分子量大小為5428 bp。線性化的pcDNA3.1(+) 分子量大小與預(yù)期相符, 證明酶切反應(yīng)成功。將酶切之后的載體和目的基因片段回收純化, 連接, 并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α, 挑取單克隆5個(gè), 送至invitrogen公司測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆序列在NCBI上比對(duì)序列(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), 將成功構(gòu)建的HECTD3基因真核表達(dá)質(zhì)粒命名為pcDNA-HECTD3。

(A)HECTD3基因的擴(kuò)增：泳道1是PCR擴(kuò)增反應(yīng)組；泳道2是陰性對(duì)照組, 以雙蒸水代替cDNA模板；泳道3是天根DL2000 Marker；泳道4是天根1 Kb DNA Marker。(B) NheI和EcoRI 限制性外切酶37℃消化載體pcDNA3.1(+) 2h, 1%瓊脂糖 凝膠檢測(cè)酶切效果：泳道1是天根1 Kb DNA Marker, 泳道2是線性化的pcDNA3.1(+)載體。

圖1 pcDNA-HECTD3真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

4 討論

HECTD3基因是Yu J等人通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的E3泛素連接酶。他們發(fā)現(xiàn)HECTD3能夠在體內(nèi)外與Tara形成復(fù)合物, 通過(guò)調(diào)節(jié)泛素化和降解Tara來(lái)參與細(xì)胞進(jìn)程［4］。HECTD3基因C端有一個(gè)高度保守的HECT domain, N端有一個(gè)功能部分受損的DOC domain, 該domain主要是用于底物特異性識(shí)別的［5,6］。也有學(xué)者通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)HECTD3能夠與Syntaxin 8形成復(fù)合物, 過(guò)表達(dá)HECTD3將會(huì)促進(jìn)Syntaxin 8的泛素化, 說(shuō)明HECTD3可能參與了神經(jīng)元的發(fā)育［7］。由于HECTD3基因ORF涉及較多的高GC含量序列, 擴(kuò)增該基因存在一定的難度。本研究采用高GC PCR buffer順利得到HECTD3基因片段并成功構(gòu)建該基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。在后續(xù)的研究中, 我們將在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)該基因的表達(dá)情況, 同時(shí)構(gòu)建該基因穩(wěn)定表達(dá)的SKOV-3細(xì)胞系, 以期深入探討體外過(guò)表達(dá)該基因所引起的一些列細(xì)胞學(xué)變化及其具體的分子機(jī)制。

［1］ Chen C, Seth A K, Aplin A E.Genetic and expression aberrations of e3 ubiquitin ligases in human breast cancer.Mol Cancer Res, 2006, 4(10): 695-707.

［2］ Li Y,Chen X,Wang Z,et al.The HECTD3 E3 ubiquitin ligase suppresses cisplatin-induced apoptosis via stabilizing MALT1.Neoplasia, 2013, 15(1): 39-48.

［3］ Jemal A,Bray F,Center M M,et al.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

［4］ Yu J,Lan J,Zhu Y,et al.The E3 ubiquitin ligase HECTD3 regulates ubiquitination and degradation of Tara.Biochem Biophys Res Commun, 2008,367 (4): 805-812.

［5］ Pál M,Varga K,Nagy O,et al.Characterization of the Apc10/ Doc1 subunit of the anaphase promoting complex in Drosophila melanogaster.Acta Biol Hung, 2007, 58: 51-64.

［6］ Kaustov L,Lukin J,Lemak A,et al.The conserved CPH domains of Cul7 and PARC are protein-protein interaction modules that bind the tetramerization domain of p53.J Biol Chem, 2007, 282(15): 11300-11307.

［7］ Zhang L,Kang L,Bond W,et al.Interaction between syntaxin 8 and HECTd3, a HECT domain ligase.Cell Mol Neurobiol, 2009, 29 (1): 115-121.

Construction of eukaryotic expression plasmid containing HETCD3 gene

LU Min-ying, YANG Bo, HE Zhi-min Cancer Research Center, Affiliated Tumor Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510095,China

Objective To clone the gene of homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3 (HECTD3) and construct the HECTD3 gene expression plasmid.Methods The HECTD3 gene was cloned from ovarian cell cDNA by PCR and recombined into the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+).Results the HECTD3 gene was confirmed in the eukaryotic expression plasmid by sequence analysis.ConclusionThe HECTD3 gene expression plasmid can be the tools for further research of ovarian cancer.

Homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain Containing 3(HETCD3); Ovarian cancer; Eukaryotic expression plasmid

510095 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所