MMP－1及MMP－3在心肌肥厚大鼠中的表達及奧美沙坦對其影響

李 涵 趙玉蘭 張 強 (鄭州大學第二附屬醫院心血管內科，河南 鄭州 450014)

心肌肥厚是多種心血管疾病的共同病理過程，其發生的結構基礎主要是心肌細胞增大和纖維化。其過程包括了心肌細胞肥大和間質成分改變，亦可稱為心肌重構。心肌重構最終導致冠脈血流儲備減少，增加心肌缺血，從而導致心衰、心律失常、猝死等。目前多項研究表明，細胞外基質(ECM)尤其是Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維的異常改變，在心肌重構中起重要作用。細胞外基質(ECM)的改建，尤其是心肌膠原的沉積與心肌細胞肥大不同步發展是促使心肌肥厚由代償向失代償轉變的主要原因之一〔1〕。多項研究已經證明心肌重構的產生與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)有關。奧美沙坦作為ARB類藥物可完全阻斷血管緊張素Ⅱ與其受體的結合，從而抑制心肌重構。本實驗建立心肌肥厚大鼠模型，觀察大鼠心肌中MMP-1、MMP-3的表達水平，并用奧美沙坦進行干預，為奧美沙坦改善心肌重構提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由鄭州大學實驗動物中心提供雄性Wistar大鼠300～350 g 30只，隨機分為對照組(甲組)、模型組(乙組)、干預組(丙組)，每組10只，三組間重量無統計學意義。

1.2 心肌肥厚模型制備 (1)三組均于大鼠背部皮下注射，甲組按3 ml·kg－1·d-1注射生理鹽水，每天 2次，連續 10 d。乙組、丙組按3 mg·kg－1·d－1注射異丙腎上腺素，每天2次，連續 10 d，同時甲、乙組生理鹽水灌胃 1 ml/d，丙組按10 mg·kg－1·d－1奧美沙坦灌胃一次，連續 10 d。(2)三組大鼠10 d用藥后稱其重量，再將各組用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，開胸取心臟，稱取全心濕重及左心室濕重。左心室一部分心肌標本保存在液氮中，用于提取RNA進行實時PCR，另一部分置于100 g/L多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋切片(5 μm)。

1.3 HE染色 將取出的心臟標本置4%多聚甲醛固定24 h(4℃)，常規石蠟包埋，沿左室長線每隔1 mm橫斷面切取數張5 μm 厚，HE 染色。

1.4 心肌肥厚組織MMP-1、MMP-3 mRNA的測定 實時熒光定量PCR測定肥厚心肌MMP-1 mRNA的相對表達。①總RNA的提取。將在液氮中凍存的樣品取出后剪碎，使用TRIzol試劑盒提取總RNA(步驟詳見說明書)。②cDNA的合成。1 μl總RNA通過隨機引物M-MLV以15 μl體系逆轉錄生成所需cDNA。③實時 PCR。MMP-1 的參數為94℃3 min，94℃ 30 s，72℃1 min，72℃5 min，40個循環。依據擴增長度配制1.5%瓊脂糖凝膠(50 ml)，微波爐加熱前加入核酸凝膠染色劑GelRed 5 μl(即稀釋至1∶10 000)，冷卻后制膠，取 5 μl PCR 產物加1.0 μl上樣緩沖液(0.25%溴芬藍，40%蔗糖)，穩壓電泳80 V約40 min。凝膠在UVP凝膠成像系統中掃描觀察結果、拍照，采用圖像分析軟件BandScan5.0分析電泳條帶的光密度值，計算MMP-1內參的光密度積分值比值作為MMP-1的相對表達量。MMP-3測定參照MMP-1。

1.5 統計學處理 應用SPSS17.0軟件處理數據，計算資料以表示，組間資料采用單因素方差分析及LSD檢驗。

2 結果

2.1 三組大鼠體重，心臟重量，左室重量，左室重量指數比較

見表1。三組實驗大鼠體重差異均無統計學意義(P＞0.05)，乙組、丙組的左室重量、心臟重量、左室重量指數都高于甲組(P＜0.05)，丙組左室重量、心臟重量、左室重量指數均低于乙組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠左室重量、心臟重量、左室重量指數和體重的比較(，n=10)

表1 各組大鼠左室重量、心臟重量、左室重量指數和體重的比較(，n=10)

與甲組比較:1)P＜0.05;與乙組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 左室重量(mg)心臟重量(mg)左室重量指數(mg/g)10 d后體重(g)甲組 614.44±4.92 753.89±9.31 1.78±0.01 344.97±5 344.48±1.63.46乙組 867.25±3.911) 970.05±5.541) 2.47±0.021) 350.83±2.91丙組760.83±4.251)2)874.56±6.611)2)2.20±0.011)2)

2.2 三組大鼠心肌組織病理改變 對照組小鼠心肌細胞排列整齊，模型組和干預組與對照組相比心肌細胞均有肥大現象，心肌間隙增寬，且模型組較干預組更為明顯。

對照組心肌細胞結構正常，排列整齊;模型組細胞明顯肥大且排列不規則，心肌組織中纖維結締組織增生;干預組大鼠的心肌細胞亦有病理損傷，但損傷程度較模型組輕。見圖1。

2.3 三組大鼠心肌MMP-1、MMP-3 mRNA表達的比較 見表2，圖2。乙組、丙組MMP-1、MMP-3 mRNA表達高于甲組(P＜0.05)，乙組高于丙組(P＜0.05)。

表2 各組大鼠心肌細胞MMP-1、MMP-3 mRNA的表達(，n=10)

表2 各組大鼠心肌細胞MMP-1、MMP-3 mRNA的表達(，n=10)

組別MMP-1 MMP-3甲組0.107±0.009 0.084±0.007乙組 0.626±0.037 0.405±0.024丙組0.313±0.018 0.196±0.013

圖1 三組大鼠心肌組織病理改變(HE，×100)

圖2 三組大鼠MMP-1、MMP-3 mRNA表達

3 討論

心肌肥厚是心臟對慢性壓力或容量超負荷產生的靶器官反應，是一種極其重要的、獨立的心血管危險因素，可使心肌缺血、心律失常、心力衰竭和猝死的幾率增加6～10倍。本實驗用異丙腎上腺素建立大鼠心肌肥厚模型〔2〕，建模10 d后通過病理學觀察，模型組和干預組心肌細胞明顯肥大，左室重量及左室重量指數均明顯高于對照組。

ECM圍繞在心肌細胞周圍，可保護心臟功能及結構的完整性。心肌肥厚的過程主要包括心肌細胞的肥大和間質的纖維化，初期的心肌肥厚有一定的代償意義，但隨著心肌間質成纖維細胞的增殖，細胞外基質只要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維沉積異常增加，是心肌結構的功能發生重塑，最終導致冠脈血流儲備減少，增加心肌缺血，從而引起心力衰竭、心律失常、猝死等。MMPs是水解ECM的蛋白裂解酶，主要由膠原構成。MMPs的表達和活性增強，可導致正常心肌膠原蛋白過度降解，并被缺乏連接結構的纖維間質取代，使心臟組織重構，最終導致心功能惡化。MMP-1可降解變性的膠原，MMP-3可作用于Ⅲ型、Ⅳ型膠原及明膠。MMP-1和MMP-3的表達水平可間接反映心肌肥厚程度。

心肌重構過程中，RAAS發揮著很重要的作用，血管緊張素Ⅱ是RAAS中最重要的效應因子，可作用于間質細胞和心肌細胞啟動重構。血管緊張素受體包含兩種不同的亞型，AT1和AT2，AngⅡ作用于心肌細胞的AT1受體，使心肌細胞蛋白合成增加、心肌肥大，與心肌重塑相關基因的表達上調，同時還可促進心肌細胞的凋亡。AngⅡ作用于心臟成纖維細胞的AT1受體，誘導組織纖維化，膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成增加，從而刺激MMP-1和MMP-3的表達和活性增強，導致正常心肌膠原蛋白過度降解，心臟組織重構。ARB是AT1受體的無活性配體，可以與AngⅡ競爭AT1的結合位點〔3〕。因此，ARB藥物的作用都是阻斷RAAS，減少AngⅡ并抑制其與配體的結合，從而達到抑制心肌重塑的目的。本試驗使用ARB類藥物奧美沙坦對心肌肥厚大鼠進行干預，結果顯示干預組的左室重量、心臟重量、左室重量指數均低于模型組，為奧美沙坦抗心肌肥厚機制提供了理論依據。

1 Berenji K，Drazner MH Rothermel BA，et al.Does load-induced ventricular hypertrophy progress to systolic heart failure〔J〕?Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005;289(1):H8-H16.

2 White P，Brestelli JE，Kaestner KH，et al.Identification of transcription networks during liver regeneration〔J〕.J Biol Chem，2005;280(5):3715-22.

3 馬曉慶，蘇勝偶.內皮素、血管緊張素Ⅱ、轉化生長因子p1與心肌肥厚關系的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2009;9(6);767-8.