C5a受體拮抗劑對小鼠缺血再灌注損傷的保護作用

鄭力通 馬銘澤 晏沐陽 (解放軍總醫院心血管病研究所，北京 00853)

大腦短暫缺血后，恢復血供時會發出一個強烈的炎癥應答，引起腦組織繼缺血后的第2次損傷，即腦缺血/再灌注(I/R)損傷。補體級聯反應是這種炎癥事件的一個重要遞質。在不同的器官系統(包括心肌、腸道、四肢)的I/R損傷都涉及補體激活，也被公認作為一個可能的I/R損傷治療靶點〔1～4〕。有針對性的觀察補體級聯反應的各個組成部分，探究腦I/R損傷的發病機制，可確定它們各自的作用和價值〔5〕。補體分子C5通過經典或替代途徑裂解成C5a和C5b，C5b同C6～C9形成膜攻擊復合物，這可能會導致細胞和細菌的裂解〔6〕。C5a是一種過敏毒素，是一種強效的炎癥細胞聚集和激活的始作俑者，因此表現出調節炎癥的特點。本文旨在探討C5a受體拮抗劑對小鼠I/R損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗用鼠 健康雄性C57Bl/6小鼠，鼠齡8～10 w、體重22～26 g，由軍事醫學科學院動物中心提供。隨機分為空白對照組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組、C5a受體拮抗劑(C5aRA)組，每組8只。在缺血發作前45 min，對每個雄性C57Bl/6老鼠按照1 mg/kg的量腹腔注射C5aRA或同等體積的PBS液體。

1.2 小鼠腦I/R模型的制作〔7〕小鼠1%戊巴比妥鈉，腹腔麻醉后，仰臥位固定，頸部中線切口。分離小鼠右側頜下腺提反向外側，分離并暴露右側的頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，并在近心端結扎頸總動脈，在遠心端結扎頸外動脈，離斷頸外動脈遠端。沿頸內動脈向深部繼續分離暴露翼腭動脈后，血管夾同時夾閉翼腭動脈。在頸外動脈遠心端用顯微剪刀剪一小口，插入制備好的線段(8個0的單絲線，長約11 mm，前段均勻包被一層硅膠使尖端圓鈍)，轉過頸總動脈分叉，進入頸內動脈。插入線段直至遇到阻力，插入長度以過頸總動脈分叉約0.8 cm為宜，即線段外露1 mm左右。插線結束后，將預先放置于頸外動脈的結扎線縛緊，以防止線段滑出和出血。頸部傷口常規縫合。60 min后，再次麻醉小鼠，分離暴露右側頸外動脈，松開固定線，拔除線段即可實現再灌注。

1.3 神經功能缺失評分 Longa 5分法評分標準:0分表示無異常;1分提尾時左前肢內收，表示輕度運動低下;2分為向左側傾斜;3分向左側旋轉;4.0分不能自行行走或昏迷。1～4分為有效模型。

1.4 腦梗死灶大小的計算 術后24 h斷頭取腦，置于小鼠腦冠狀切片磨具中，切成2 mm厚片。將切片置于2%紅四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液中，避光染色30 min后，置于10%多聚甲醛中固定。白色為梗死灶，紅色為正常腦組織。應用圖像分析系統測量腦梗死面積。根據公式V=t×(A1+A2+…+An)算出梗死體積。其中t為切片厚度，A為每個切片尾側梗死面積，n為單個鼠腦的切片數。t=2 mm，n=4。

1.5 組織病理學觀察 術后24 h，1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉后，開胸暴露心臟，用PBS心臟沖洗后，4%多聚甲醛(pH7.2～7.4)灌注，斷頭取腦，置于相同灌注液12 h后依次脫水、透明、浸蠟及包埋，行5 μm厚冠狀切片，進行HE染色。

同樣，C5與其他器官系統的再灌注損傷也有關聯。C5aRA是一種環肽。目前研究最廣泛的是AcF〔OpdChaWR〕(PMX-53)。已被證明在不同的嚙齒動物疾病模型中可明顯阻礙C5a的介導效果〔11〕。局部缺血前應用C5aRA能充分抑制I/R誘導的腎損害〔12〕。此外，抗C5抗體和C5aRA都已被證明減弱局部缺血鼠小腸的再灌注損傷〔13，14〕。這些發現表明，與遺傳缺陷對比，在缺血前期改變C5或C5a的活性對急性炎癥更有針對性，從而限制再灌注損傷。

但C5a受體介導確切的調節機制仍然未知。未來的研究必須闡明作用機制，即通過上調腦中C5aR后腦I/R損傷和靶向，來調解其效能。此外，繼續努力追蹤驗證缺血后療效。定義C5a受體抑制對I/R損傷的治療窗將至關重要，在評估其治療I/R損傷相關目標的臨床潛能。此外，鑒于在心肌缺血患者亞組的抗C5療法最近的臨床療效和安全性特點〔15〕，應觀察腦缺血中C5a的作用以及其在I/R損傷治療中的深遠潛力和有利進展。

2 結果

2.1 梗死體積 與PBS組(35.0% ±2.1%)比較，C5aRA組梗死體積(26.2% ±2.5%)顯著減少(P=0.02)。見圖 1。C5aRA組梗死體積比PBS組減少了26%。

圖1 兩組梗死體積

2.2 神經功能缺損 C5aRA組(2.3±0.15)比PBS組(2.4±0.11)在神經功能缺損評分上有改善的趨勢(P=0.09)。

3 討論

腦血管疾病發病機制及安全有效的治療措施目前還不清

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