手術創傷對成年鼠和老年鼠海馬區炎性因子表達的影響

曹學照 劉 芳 馬 虹 (中國醫科大學附屬第一醫院麻醉科，遼寧 沈陽 000)

手術和麻醉后，很多老年患者出現認知功能下降，被稱之為術后認知功能障礙(POCD)。許多病理生理機制已用于解釋POCD的可能機制，但確切的機制仍不明確。手術創傷、麻醉和應激可導致患者術前非特異性炎癥反應。炎性因子在手術和創傷引起的炎癥反應中起到重要作用。本研究擬探討手術創傷對海馬區炎性因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 成年鼠和老年鼠手術創傷模型的建立 雄性成年SD大鼠(3～6月齡)和老年SD大鼠(18～20月齡)分別隨機分為對照組(12只)、麻醉組(36只)和手術組(36只)。所有實驗動物都維持室溫23℃，黑白周期12 h輪轉，給與充足的食物和水。所有動物都在這樣的環境熟悉7～10 d。對照組SD大鼠不做特殊處理。麻醉組實驗動物單純接受1.5%～2%異氟烷麻醉，行氣管插管和機械通氣。手術組SD大鼠行肝部分切除術。具體步驟:手術切口處備皮、消毒，在上腹部正中線做一小切口，游離切除左側肝臟，傷口用0.25%布比卡因浸潤，然后用縫線縫合，所有手術步驟均無菌操作。實驗鼠在術后1、3、7 d檢測海馬區白介素(IL)-1β，IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA和蛋白表達變化。

1.2 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測大鼠術后1、3、7 d海馬區炎性因子mRNA的表達

1.2.1 引物設計 應用引物設計軟件Primer 5.0設計PCR引物，由大連Takara公司合成引物序列(見表1)。

1.2.2 兩步法RT-PCR (1)反轉錄為cDNA:cDNA的合成主要利用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒合成。(2)PCR 反應:反應體系為 40 μl(5 × 緩沖液10 μl，dNTP 4 μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5 μl，Taq聚合酶0.25μl，ddH2O28.75 μl，cDNA 產物 2 μl)。反應條件:退火溫度按各引物要求變化，其余反應條件相同。(3)PCR產物檢測:PCR反應結束后，用5 μl PCR產物和1 μl GeneFinderTM染料混合，上樣至2%瓊脂糖凝膠，以100 bp DNA Ladder Marker(TaKaRa，中國)作為DNA片段長度標記，150 V電壓下電泳45 min，利用凝膠成像系統，確定是否擴增出目的條帶。mRNA的量由特異性基因mRNA和β-actin mRNA的比值來表示。

1.3 免疫蛋白印跡雜交測定IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達分別裂解各組細胞，收集上清，測定蛋白質濃度，然后按每個電泳孔道加入50 μg蛋白混合樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜。先后加入一抗(IL-1β、IL-6、TNF-α)和二抗(羊抗兔單克隆抗體)進行雜交。然后進行酶標染色顯色，應用圖像分析軟件分析各電泳條帶的蛋白含量。

1.4 統計學方法 計量資料組間比較行兩因素方差分析，Student t檢驗。所得數據以±s表示。

2 結果

2.1 手術創傷對海馬區炎性因子mRNA表達的影響 兩因素方差分析海馬區炎性因子 mRNA的表達顯示，時間(P＜0.001)和年齡(P＜0.001)在IL-1β，IL-6和 TNF-α mRNA上有統計學差異(表2)，成年鼠和老年鼠海馬區 IL-1β，IL-6和TNF-α mRNA在基礎水平存在統計學差異(P=0.041，P=0.012和P=0.035)，蛋白水平無統計學差異。單純麻醉因素沒有明顯改變成年鼠和老年鼠海馬區炎性因子的表達。成年鼠海馬區IL-1β和 IL-6 mRNA僅在手術后第1天(P＜0.001)明顯增高，但老年鼠海馬區IL-1β和IL-6 mRNA增多持續到手術后3 d(P＜0.001)(表2)。TNF-α mRNA僅在老年鼠手術后1 d(P＜0.001)明顯增加，在成年鼠沒有明顯改變(P=0.095)(表2)。這些結果證明手術創傷可明顯增加海馬區炎性因子的表達，這種改變尤其在老年鼠明顯，老年鼠海馬區炎性因子表達上調更明顯，持續時間更長。見圖1。

2.2 手術創傷對海馬區炎性因子蛋白表達的影響 利用兩因素方差分析海馬區炎性因子蛋白的表達顯示，時間(P＜0.001)和年齡(P＜0.001)在IL-1β，IL-6和 TNF-α蛋白上有統計學差異(表3)，成年鼠和老年鼠海馬區IL-1β，IL-6和TNF-α mRNA蛋白在基礎水平無統計學差異。IL-1β和 IL-6蛋白僅老年鼠在術后第1天表達增加(P＜0.01;P＜0.05)，第3天無統計學差異。TNF-α蛋白在成年和老年鼠術后無統計學差異。見圖1。

圖1 手術創傷對海馬區炎性因子蛋白表達

表1 各引物序列及擴增長度

表2 手術創傷對海馬區炎性因子mRNA表達(±s，n=12)

表2 手術創傷對海馬區炎性因子mRNA表達(±s，n=12)

與成年鼠比較:1)P＜0.05;與各自年齡段對照組比較:2)P＜0.001

1.39±0.63 1.04±0.23老年 1.26±0.201) 5.73±0.652) 3.73±0.502) 1.26±0.21 IL-6 成年 0.98±0.23 2.29±0.342) 1.285±0.14 1.08±0.24老年 1.22±0.221) 3.43±0.252) 2.25±0.152) 1.16±0.21 TNF-α 成年 0.58±0.12 0.80±0.21 0.64±0.11 0.570.09老年 0.79±0.111) 1.28±0.142)P1 P3 P7 IL-1β 成年 1.01±0.25 3.13±0.852)對照組0.87±0.08 0.74±0.10

表3 手術創傷對海馬區炎性因子mRNA表達(±s，n=12)

表3 手術創傷對海馬區炎性因子mRNA表達(±s，n=12)

與成年鼠比較:1)P＜0.05;與各自年齡段對照組比較:2)P＜0.001

0.78±0.15 1.43±0.76 0.87±0.53 0.84±0.27老年 0.80±0.22 1.78±0.651)1.35±0.31 0.88±0.23 IL-6 成年 0.76±0.27 1.29±0.36 0.87±0.12 0.82±0.20老年 0.78±0.25 1.92±0.282)1.02±0.14 0.86±0.23 TNF-α 成年 0.53±0.11 0.65±0.20 0.58±0.13 0.56±0.11老年P1 P3 P7 IL-1β 成年對照組0.65±0.10 0.71±0.14 0.74±0.11 0.68±0.12

3 討論

本實驗探討了手術創傷對成年鼠和老年鼠海馬區炎性因子表達的影響。實驗證實手術創傷引起了成年鼠和老年鼠海馬區IL-1β，IL-6和TNF-α表達的增加。與成年鼠相比，老年鼠海馬區炎性因子表達更強烈，持續時間更長。炎性因子表達變化與實驗鼠認知功能障礙變化相一致。炎性因子可能介導了實驗鼠術后認知功能障礙。許多病理生理機制已用于解釋POCD的可能機制，但確切機制仍不明確。已有報道手術創傷、麻醉和應激可導致患者術前非特異性炎癥反應〔1〕。炎性因子在手術和創傷引起的炎癥反應中起到重要作用。以前的動物實驗顯示通過注射脂多糖(LPS)激活外周免疫系統可引起外周和中樞神經系統炎癥，如IL-1，IL-6，TNF-α，這些炎性因子可通過直接或者間接的機制影響認知功能〔2〕。海馬區激活的膠質細胞釋放的炎性因子可導致記憶和學習能力的下降，以及長時程增強(LTP)的破壞。與年齡相關的膠質細胞活性的改變可加劇老年患者炎癥反應的程度〔3〕，所以老年人術后容易出現認知功能障礙。與成年鼠相比，激活中樞神經免疫系統，老年鼠更容易發生神經炎癥反應和認知功能破壞〔4〕。

炎性因子就如同一把雙刃劍，它既能保護神經功能，但過量或者長期表達也能起到破壞作用。實驗已經證明中樞神經系統大量炎性因子表達可導致運動協調功能和認知功能的破壞〔5〕。海馬區是腦內炎性因子受體表達的聚居區，似乎對過量的或者慢性炎性因子表達更敏感〔6〕。在正常生理情況下，炎性因子在中樞神經系統不存在。但在病理狀態下表達迅速升高。炎性因子可結合中樞神經系統相應的受體，激活小膠質細胞和血管內皮細胞，引起一系列的炎癥反應和其他效應〔6〕。

阻滯腦內炎性因子受體可以改善因激活外周免疫系統引起的行為學抑制。文獻證實外源性的IL-1β能夠引起免疫反應和認知功能破壞，但側腦室注射IL-1β受體拮抗劑可改善破壞的認知功能，給予IL-6受體拮抗劑能延長LTP，改善空間記憶能力和改善由于LPS引起的行為學抑制〔7〕。這些研究證實了炎性因子在調節行為學和認知功能方面的重要作用。

綜上所述，手術創傷引起了成年鼠和老年鼠海馬區炎性因子表達增加，加上我們前期試驗已經證實手術創傷引起了成年鼠和老年鼠空間學習記憶能力的損害，炎性因子可能介導了實驗鼠術后認知功能障礙。

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2 Thomson LM，Sutherland RJ.Systemic administration of lipopolysaccharide and interleukin-1beta have different effects on memory consolidation〔J〕.Brain Res Bull，2005;67(1):24-9.

3 Godbout JP，Johnson RW.Age and neuroinflammation:a lifetime of psychoneuroimmune consequences〔J〕.Neurol Clin，2006;24(3):521-38.

4 Chen J，Buchanan JB，Sparkman NL，et al.Neuroinflammation and disruption in working memory in aged mice after acute stimulation of the peripheral innate immune system〔J〕.Brain Behav Immun，2008;22(3):301-11.

5 Griffin WS，Liu L，Li Y，et al.Interleukin-1 mediates Alzheimer and Lewy body pathologies〔J〕.J Neuroinflammation，2006;3(5):5-14.

6 Parnet P，Kelley KW，Bluthe RM，et al.Expression and regulation of interleukin-1 receptors in the brain:role in cytokines-induced sickness behavior〔J〕.J Neuroimmunol，2002;125(1):5-14.

7 Johnson JD，O'Connor KA，Watkins LR，et al.The role of IL-1beta in stress-induced sensitization of pro-inflammatory cytokine and corticosterone responses〔J〕.Neuroscience，2004;127(3):569-77.