建蘭花葉病毒外殼蛋白基因和3′UTR序列測定與分析

鄭國華， 蘇勇波， 鄭志忠， 彭德偉， 明艷林＊

（1.廈門華僑亞熱帶植物引種園，國家農(nóng)作物國外引種隔離檢疫基地，廈門市引種檢疫與植物源產(chǎn)物重點實驗室，廈門 361002；2.廈門兆翔花卉科技有限公司，廈門 361010）

建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）屬于馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus）成員，是危害蘭科植物最為嚴重的病毒之一［1］。調(diào)查表明國內(nèi)蘭花普遍受到該病毒的危害，特別是蝴蝶蘭、文心蘭、大花蕙蘭、墨蘭等蘭花種類［2－3］。該病毒基因由約6200nt的單鏈正義RNA組成，5′端帶有一個甲基化的核苷酸帽子結構，3′端帶有一個poly（A），共編碼RNA聚合酶、TGBp1、TGBp2、TGBp3和CP等5個蛋白［4］。Potexvirus屬病毒的CP在病毒復制、組裝和移動等過程中都發(fā)揮著重要的作用［5］，因此CP基因被廣泛用于開展介導抗病毒研究［6］。國內(nèi)外學者先后將CyMV的CP基因轉(zhuǎn)入石斛蘭（Dendrobium）原球莖［7］、本塞姆氏煙（Nicotiana benthamiana）［8］、西方煙（Nicotiana occidentalis）［9］等寄主，發(fā)現(xiàn)病毒的復制和積累受到明顯抑制，展示了CP基因介導抗性的優(yōu)勢。但是在馬鈴薯Y病毒和番木瓜環(huán)斑病毒等CP基因介導應用研究中發(fā)現(xiàn)，CP基因介導的轉(zhuǎn)基因植株對不同分離物的抗性存在著明顯的差異［10－11］，從而限制了該抗性技術的應用。CyMV 分離物間CP基因（相似性85%～100%）存在明顯遺傳變異性［12］，因此有必要分析病毒CP基因遺傳變異和進化趨勢，尋找穩(wěn)定遺傳的保守序列開展抗性基因的研究。

正單鏈RNA病毒3′UTR的序列及其二、三級結構在病毒RNA復制酶啟動合成負鏈RNA時具有非常重要的作用，許多研究發(fā)現(xiàn)3′UTR可以通過形成的莖環(huán)結構、類tRNA結構和Poly（A）等方式參與病毒復制調(diào)控［13］。目前，Potexvirus屬的竹花葉病毒（Bamboo mosaic virus，BaMV）3′UTR結構與功能研究較為深入，BaMV的3′UTR能夠形成類似三葉草莖環(huán)結構A、B、C和D，形成類似tRNA的假結結構［14］。RDRP能特異結合3′UTR，啟動負鏈RNA的合成，敲除3′UTR不同部位都能影響RNA復制［15］。CyMV與BaMV同屬于Potexvirus，具有非常相似的基因組成，因此研究CyMV 3′UTR的結構和功能將有可能進一步揭示病毒復制調(diào)控機制。

本文采用單鏈構象多態(tài)性分析（single－strand conformation polymorphism，SSCP）快速檢測侵染不同蝴蝶蘭品種CyMV存在的遺傳變異，從中篩選得到5個存在變異的分離物并測定其CP和3′UTR基因序列。進一步與其他分離物的CP基因進行比較分析，研究CP基因存在的遺傳多樣性和作用于CP基因的選擇壓力，為開展抗病毒研究奠定基礎。并通過軟件預測3′UTR二級結構，以期為深入研究該復制調(diào)控區(qū)域的結構和功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 病毒毒源

蝴蝶蘭病株采自廈門蝴蝶蘭種植圃（品種編號：pl335、kq5503、kq6113、kf540、kf1023、jt1017、ypm166、j02037），均為組培分生苗，葉片出現(xiàn)褪綠、花葉和環(huán)斑等癥狀。經(jīng)斑點酶聯(lián)免疫檢測篩選后，將病葉研磨后摩擦接種到曼陀羅上進行單斑分離和保存。采用接種建蘭花葉病毒的曼陀羅病葉作為陽性對照，并以未接種病毒的曼陀羅葉片作為陰性對照。

1.1.2 試劑

CyMV斑點酶聯(lián)檢測試劑由本實驗室制備。cDNA合成試劑盒、Taq聚合酶購自Promega公司。內(nèi)切酶Pst I、T－A克隆試劑盒、感受態(tài)細胞JM109、Trizol試劑盒、DNA膠回收試劑盒等均購自上海生物工程有限公司。分析已知分離物間的保守序列，根據(jù)保守序列設計3條引物，委托上海桑尼生物工程有限公司合成。引物5Fa（對應AM055640的4900～4923nt）：5′－GTGTTAGCTTTTACTGCAGTGATC－3′、引物4R（與 AM055640的5278～5298nt 互 補 ）：5′－ATTGCCAGGATGGTAGGAAA－3′；引 物 M4T（與 poly（A）互 補 ）：5′－GTTTTCCCAGTCACGACTTTTTTTTTTTT－3′，其中5Fa／4R引物對預期擴增條帶大小為399bp，5Fa／M4T引物對預期擴增條帶約為1350bp。

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR

采用Trizol試劑盒分別提取8個樣品、陽性對照和陰性對照葉片總RNA，采用cDNA合成試劑盒合成cDNA。用5Fa／M4T引物對擴增部分TGB－ps、全長CP和3′UTR基因序列，PCR擴增體系如下：50μL 總體積包括 10 × PCR buffer 5μL、dNTP mix（10mmol／L）1μL、引物5Fa（10μmol／L）和 M4T（10μmol／L）各2μL、cDNA 1μL、Taq酶（5U／μL）0.4μL；補充ddH2O至50μL。PCR反應程序：94℃預變性10min，先進行94℃45s、50℃30s、72℃120s5個循環(huán)后將退火溫度提高58℃再進行24次循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.2 SSCP

取PCR產(chǎn)物稀釋1×105后作為模板，用5Fa／4R引物對擴增TGB部分序列，PCR擴增體系同1.2.1。PCR反應程序：94℃預變性5min，94℃30s、58℃20s、72℃30s，共24個循環(huán)，72℃延伸5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后，取純化產(chǎn)物2μL加入4μL上樣緩沖液（95%甲酰胺、0.5%溴酚藍），混勻后于95℃變性10min，取出立即冰浴5min后上樣。將電泳槽置于4℃冰箱內(nèi)，先使用10V／cm電壓電泳5min后，改用4V／cm電壓電泳12h。EB染色30min后在紫外燈下觀察。

1.2.3 序列測定與分析

將5Fa和M4T擴增得到的8份PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后，分別與pUCm－T載體進行連接轉(zhuǎn)化DH5α，篩選得到pUmcy07（pl335）、pUmcy11 （kq5503）、pUmcy18 （kq6113）、pUmcy42（kf540）、pUmcy46（kf1023）、pUmcy54（jt1017）、pUmcy58（ypm166）和pUmcy59（j02037）等陽性克隆，委托上海生物工程有限公司進行序列測定。通過 Clustal Omega－Multiple Sequence Alignment（http：∥www.ebi.ac.uk／Tools／msa／）軟件進行序列分析，通過基于Nei ＆Gojobori方法的SNAP在線分析軟件（http：∥www.hiv.lanl.gov／content／sequence／SNAP／SNAP.html）分析CP基因各位點非同義置換率（dN）和同義置換率（dS）值。采用RNAshapes軟件分析3′UTR形成的二級結構。

2 結果

2.1 RT－PCR擴增結果

經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，采用5Fa和M4T這對引物從來自8個蝴蝶蘭品種的CyMV分離物中均能擴增得到1300bp左右的目的條帶。由于M4T引物與Poly（A）結合位點略有不同，擴增片段大小應該存在一定差異，但這種差異在電泳圖中沒有得到體現(xiàn)（圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)稀釋后作為模板采用5Fa和4R這對引物進行擴增均能得到400bp左右的目的條帶（圖2）。

圖1 引物對（5Fa和M4T）PCR擴增產(chǎn)物電泳分析Fig.1 Electrophoresis of PCR products using the primers 5Fa／M4T

圖2 引物對（5Fa和4R）PCR擴增產(chǎn)物電泳分析Fig.2 Electrophoresis of PCR products using the primer 5Fa／4R

2.2 變異分離物篩選

采用SSCP對5Fa和4R擴增得到的8個產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過優(yōu)化SSCP條件均得到穩(wěn)定的帶型（圖3）。8個分離物擴增片段均出現(xiàn)2個條帶，總共有5個帶型，其中kf1023、jt1017和ypm166帶型一 致，kf540、j02037 帶 型 一 致，pl335、kq5503、kq6113分離物帶型差異明顯。通過條帶存在的多態(tài)性，推測這8個分離物由5種存在明顯差異的分離物組成。進一步提取8個分離物重組質(zhì)粒委托測序，結果表明5Fa和4R擴增片段大小均為399bp。通過序列分析比對發(fā)現(xiàn)，pUmcy46（kf1023）、pUmcy54（jt1017）和 pUmcy58（ypm166）序列一致，pUmcy42（kf540）、pUmcy59（j02037）序列一致，其他3個分離物各不相同（圖4），與SSCP分析結果一致。

圖3 PCR產(chǎn)物單鏈構象多態(tài)性電泳分析Fig.3 Electrophoresis of SSCP products of 8isolates

圖4 8個分離物擴增片段堿基變異分析Fig.4 Molecular differentiation of 8isolates

2.3 CP基因進化樹分析

根據(jù)SSCP分析和序列測定分析結果，本文對pl335、kq5503、kq6113、kf1023、j02037等分離物 CP基因進行分析，通過分析發(fā)現(xiàn)它們的相似性為95.5%～99.9%。從已知GenBank登錄的130個分離物CP基因序列中選擇具有代表性的56個登錄序列和本研究的5個序列建立系統(tǒng)進化樹（圖5），分析表明這5個分離物都屬于亞組A。其中pl335（圖5：Phalaenopsis－pUmcy07）、kq6113（Phalaenopsis－pUmcy18）和 kf1023（Phalaenopsis－pUmcy46）3個分離物間相似性為99.4%～99.9%，與來自廈門（GQ507023）、廣東（FJ356061）蝴蝶蘭分離物親緣性較近（相似性為98.1%～98.8%）。kq5503（Phalaenopsis－pUmcy11）和 j02037（Phalaenopsis－pUmcy54）2個分離物間相似性為97.6%。與來自浙江（DQ067884、DQ067885）、福建（DQ067879）、廣東（AY360410）建蘭分離物親緣性較近（95.2%～97.6%）。分析分離物間的地理分布和寄主發(fā)現(xiàn)，各分離物間不存在明顯的地域和寄主相關性。

2.4 CP基因dN和dS的分析

對CP基因各堿基非同義替代率（dN）和同義替代率（dS）進行計算，dN 平均為0.0418，dS平均為0.1205，平均dN／dS為0.3379，說明CP基因全長仍然為負向選擇。通過SNAP分析的dN和dS分布（圖6），可以看到CP的N端dN＞dS，表明受到正選擇壓力的作用，氨基酸發(fā)生變異的頻率較高；而CP的C端dN＜dS，表明受到負選擇壓力的作用，在病毒進化過程中會凈化這些變異。

圖5 CP基因系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree based on CP nucleotide sequences between different isolates of CyMV

2.5 3′UTR二級結構預測

分析3′UTR序列發(fā)現(xiàn)含有Potexvirus屬病毒RNA合成必需的順式元件“AC（C／T）TAA”和Poly（A）信號“AATAAA”。采用RNAshapes軟件預測3′UTR形成的二級結構，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域能夠形成類似三葉草莖環(huán)結構（圖7A），順式元件位于莖環(huán)結構A中，推測該區(qū)域在啟動負鏈RNA合成的過程中具有重要作用。

圖6 CP基因核苷酸的非同義替代率（dN）和同義替代率（dS）Fig.6 Cumulative plot of average nonsynonymous nucleotide substitution（dN）and average synonymous nucleotide substitution（dS）represented codon by codon

進一步分析各分離物的3′UTR存在的遺傳變異（圖7B），發(fā)現(xiàn)10位（A／T）、28位（C／T）、31位（A／T／G）、47位（G／A）、59位（A／T／C）、60位（A／T／G）、61位（C／T）等變異位點均位于未配對區(qū)域，它們間的變異沒有改變莖環(huán)結構；位于配對區(qū)域的49位（C／T）和68位（A／G）則是分別形成 A－T和G－C配對的穩(wěn)定結構。56位堿基A出現(xiàn)缺失和突變?yōu)镚的情況降低了莖環(huán)穩(wěn)定性。由此可見，各分離物進化過程中始終保持這種二級結構的穩(wěn)定，推測這種結構對病毒具有重要意義。

3 討論

Zhou等［16］根據(jù)CP基因序列相似性進行進化樹分析，認為CyMV分離物間親緣關系與地理位置大體相關，亞洲各分離物和夏威夷分離物以很高相似系數(shù)聚集在一起，歐洲各分離物集成一大類，新加坡的一個分離物和泰國分離物是特例。Moles等［17］則明確這兩類分離物劃分為亞組A和亞組B。本文通過將這5個分離物與其他分離物進行比對，結果發(fā)現(xiàn)它們都屬于亞組A，未發(fā)現(xiàn)亞組B成員。進一步分析各分離物CP基因的非同義替代／同義替代率，發(fā)現(xiàn)該CP基因5′端存在較高的非同義替代，推測該區(qū)域的變異是病毒應對不同寄主和環(huán)境選擇壓力的策略。CP基因3′端普遍發(fā)生同義替代，編碼的氨基酸序列較為保守，因此可以作為抗性研究的重點。

圖7 CyMV 3′非編碼區(qū)莖環(huán)結構預測Fig.7 Stem－loop structure prediction of CyMV 3′UTR

CyMV 3′UTR形成的類似三葉草的莖環(huán)結構在同屬的BaMV已經(jīng)得到驗證，而且CyMV不同分離物間的變異始終都維持著這種結構的穩(wěn)定性，由此可以推測這種結構對于病毒具有非常重要的作用。但是目前僅僅通過分子結構的熱力學穩(wěn)定性進行模擬，其結構和功能還有待進一步的試驗驗證。

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