2011至2012年徐匯區致瀉性大腸埃希菌病原學監測與流行病學研究

趙雪濤，高 昆，張春華

(上海市徐匯區疾病預防控制中心微生物檢驗科，上海 200237)

致瀉性大腸埃希菌(diagrrheagenic Escherichia coli，DEC)包括致病性大腸埃希菌(entreopathogenic Escherichia coli，EPEC)、產毒性大腸埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)、侵襲性大腸埃希菌(enteroinvasive Escherichia coli，EIEC)、腸出血性大腸埃希菌(enterohoemorrhagic Escherichia coli，EHEC)和聚集性大腸埃希菌(entroaggregative Escherichia coli，EAEC)，是重要的引起腹瀉的病原性細菌。近年來國內外的報道還有彌散性聚集大腸埃希菌(dissfuely adheret Escherichia coli，DAEC)、產非洲綠猴腎細胞(Vero)毒素大腸埃希菌[1]。因其致病基因多種多樣，病理過程各異，且目前我國大多數的臨床微生物實驗室針對腸道病原菌的分子檢測較不普及，依然沿用傳統的分離培養方法，故檢出率較低，對于病原菌本身了解不多，對于DEC的流行病學特征了解較為缺乏。本次研究監測2011年6月至2012年5月的徐匯區某醫院腸道門診病例，按照上海市腸道傳染病監測方案的要求規范采樣，進行DEC的持續監測，以求了解和掌握本區域內DEC的病原學特點和流行病學特征。

材料和方法

一、標本與病例選擇

來自于2011年6月至2012年5月的徐匯區某醫院腸道門診病例，按照上海市腸道傳染病監測方案的要求規范采樣，采樣于運送培養基(carrierblair培養基)，24 h內送至實驗室初次分離接種。

二、方法

1.細菌接種分離培養 標本直接于SS培養基劃線分離，37℃培養20 h后挑取形態為粉紅色、發酵乳糖的單個菌落，純分離接種營養瓊脂斜面和LB肉湯培養基，37℃培養8 h后備用。營養瓊脂的純分離用于進行生化反應鑒定。

2.革蘭染色 使用珠海貝索的革蘭染液。

3.大腸埃希菌屬的生化鑒定 使用VITEK COMPACT全自動細菌鑒定儀和革蘭陰性菌鑒定卡(GN)鑒定。

4.細菌核酸提取 使用煮沸法。挑取單個欲測試菌落，在含 0.1%Triton X-100、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acide，EDTA)的100 μL配制溶液的離心管中懸浮，放入100℃金屬浴中5 min，然后用微量離心機于室溫以12000×g離心5 min，取上清即可用于聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測。

5.PCR反應體系 鎂離子濃度為5 mmol/L，上下游引物濃度各為250 nmol/L，探針濃度為150 nmol/L，DNTP 濃度為 0.2 mmol/L，Taq 酶為2 IU，模板 3 μL，用 ddH2O 補足總體積為 30 μL。

6.PCR反應條件 37℃ 2 min，94℃ 3 min;94℃ 10 s，60℃ 40 s，40個循環;在60℃時檢測熒光值。

7.DEC各毒力基因引物和探針序列 以premier公司的beacon designer 7.90版本的軟件直接獲取基因編號序列，用軟件選取上下游引物和taqman探針。見表1。

表1 DEC各毒力基因引物和探針序列

8.儀器與試劑 Biorad IQ5熒光定量PCR儀，PCR用引物、探針及 DNTP等試劑均由上海賽百盛生物技術有限公司合成，選用的培養基均來源于上海市疾病預防控制中心培養基室，且所有試劑耗材均在有效期內使用。

三、統計學方法

采用Stata 7.0統計軟件進行 χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、整體陽性率和各類DEC的陽性率

2011年6月至2012年5月共檢測標本834例，其中 EPEC(Eae+和/或 Bfpa+)21株，ETEC(ST+和/或 LT+)55 株，EHEC(Eae+且 VT1+和/或 VT2+)2株，EAEC(AggR+)19株，DAEC(DraaC+)42株，eastA+檢出51株，EIEC(Ial+)未檢出。見表2、圖1。

表2 2011年6月至2012年5月DEC監測整體情況

圖1 DEC監測月度陽性分布圖

二、年齡分布

ETEC、EPEC和EHEC各年齡組陽性例數無明顯差異，EAEC多見于小年齡組，DAEC多見于老年齡組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

三、性別分布

在 ETEC、EPEC+EHEC、EAEC、DAEC、eastA+各類檢出陽性病例中，男女性別分布差異無統計學意義(P＜0.05)。見表4。

四、ETEC的陽性月度分布特征

ETEC共檢出55株，在各類DEC中檢出率居首，在年度的5月至11月均有檢出，此后各月均未檢出。ETEC明顯高發于夏季，有明顯的季節性特征。見圖2。

表3 DEC檢出病例的年齡組分布特征

表4 DEC檢出病例的性別差異分布

圖2 ETEC(ST+和/或LT+)陽性檢出分布圖

五、EPEC和EHEC的陽性檢出情況與月度分布

EHEC在監測期間共檢出2例，呈散發狀態，EPEC多見于春末夏初(5、6、7月份)、夏末及秋季(10、11、12、1 月)。見圖3。

圖3 EPEC和EHEC(Eae+和/或VT1+/VT2+)陽性檢出分布圖

六、EAEC、DAEC及ETEC的陽性檢出月度分布

EAEC共檢出19株，DAEC共檢出42株，ETEC共檢出55株。EAEC呈波動特征，全年幾乎都有發生，季節性不明顯;DAEA和ETEC具有季節性背行分布特征。見圖4。

七、EPEC與EHEC血清型的關聯性

EPEC 檢出 O55、O26、O111、O128、O157 等多個血清型，而檢出的2例EHEC分別為O111和O157。同一血清型別但攜帶毒力基因的不同是分類差異的原因，這提示某些血清型型別的EPEC可能更容易受噬菌體感染而導致基因整合后攜帶Vero細胞毒素基因片段。

圖4 EAEC、ETEC和DAEC的陽性檢出月度分布圖

八、eastA+株

在所有的ST+株中都攜帶有eastA，在EPEC中同時有 eastA+為28.57%(6/21)，EAEC 中同時有eastA+為63.84%(7/19)，DAEC 中同時有 eastA+為38.09%(16/42)。除此之外，僅eastA毒力基因片段陽性檢出為6.12%(51/834)，僅次于ETEC。

討 論

DEC屬于最常見的大腸埃希菌的一類，也是引起腹瀉的常見病原菌之一。國內對于DEC的檢測報道多為突發事件的個案報告[4-6]，作為最易培養和最常見的腸道病原菌之一，卻因為形態難以簡單識別、分類方法定義不明確、新方法開展不普及而造成國內大多數實驗室對于DEC的檢測與監測一直未能有效持續的開展，在此基礎上對其流行病學規律與特征的研究更無從談起。

本研究選取了包含最常見分類的各個毒力基因片段設計的探針和引物序列，新增DAEC與eastA的2個比較新的毒力基因片段，對上海市徐匯區的臨床腸道門診腹瀉病例進行了1年多的連續性監測，按照不同的統計分類，DEC年度整體的感染率為腸道門診腹瀉病例的9%(EIEC+EPEC+ETEC+EHEC)、12%(含 EAEC)、17%(含EAEC 和DAEC)、23%(含eastA+)，有季節性的變化，夏秋季節較高，冬春季節稍低。在各類別DEC中，ETEC的高峰在夏季的7～9月份;EPEC雖然整體占比不高，但1年中的5～11月份占有一定的比例，若帶有VT毒素基因的EHEC致病性更強，造成的癥狀更嚴重。

此次監測結果提示我們DEC具有以下幾方面的特征:(1)全年陽性率波動(單月陽性率3:14%～23%)的狀況下，陽性檢出率結構性的特征明顯，如ETEC與DAEC的發病時間交替與錯峰，在單一型別高發期間(如8～9月份的ETEC和1～2月份DAEC)，其他型別則幾乎不檢出;(2)本區域內的DAEC加EAEC的感染發病率甚至要超過季節性高峰的ETEC全年發病率，EAEC和 DAEC致病過程為聚集黏附，尤其是DAEC幾乎沒有主動黏附機制，致病性不強，多數是癥狀較輕的病例，EAEC整年都有一定比例，但人群分布特征明顯，主要是少兒(＜6歲)和老人(＞65歲)，尤其是少兒的比例更高;DAEC高發期為冬季的12～2月份，人群特征主要為老人;(3)在此次的監測中存在大量的單基因eastA+株，eastA原為EAEC的一個非特異性的毒力基因，一般認為其與EAEC和DAEC關系密切，eastA單陽性株的存在究竟是EAEC和DAEC的變異還是普通大腸埃希菌接受了EAEC和DAEC的質粒而獲得部分毒力，這值得進一步深入研究。

DEC較常見，其形態與普通大腸埃希菌無異，傳統檢測僅僅依靠培養加血清凝集的方法，繁瑣且低效。隨著國外近年來在DEC的分類與鑒別中的進展，血清學定型與分型很難再作為確定分類的依據，在某一個血清型別之下，因為攜帶的毒力基因的不同也可能被分為不同的EPEC或EHEC，而且由于很多的毒力基因都由大腸埃希菌的質粒攜帶[7]，質粒的傳遞會造成原本某一血清型別的大腸埃希菌變為分型意義上的另一類。DEC的致病性以及分類的模糊與其質粒攜帶的毒力基因的轉移和溶原性噬菌體的序列整合有關，如2011年在德國爆發的引起大面積感染的病原O104的血清型[8]，其攜帶 AggR+質粒，而且 Eae、VT1 和/或 VT2毒力基因陽性，因其引起的癥狀為溶血性尿毒綜合征，而被分類為EHEC，但其攜帶的AggR+質粒，是EAEC的特異性毒力基因，故而也有將O104稱為EHAEC[9]。

近年來國外對于DEC致病性、分類乃至體內、體外的生物學特征和分子生物學致病機制的研究已取得了長足的進步，國內由于沒有廣泛的、完整的、持續的監測實踐作為基礎，無論是實驗室還是流行病學人員對DEC的流行病學特征、檢測手段、分類分型特征、遺傳變異等各方面的了解都亟待提高。

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