雙試劑速率法測定二胺氧化酶活性的研究

胡進訪，吳 雁，王白石，王 旭

(1.天津市泰達醫院檢驗科，天津 300457;2.天津醫科大學醫學檢驗學院，天津 300203)

二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO，E.C.1.4.3.6)是人和哺乳動物小腸黏膜絨毛和胎盤絨毛中具有高度活性的細胞內酶，在二胺(組胺、腐胺和尸胺)代謝中起催化作用，其與腸黏膜細胞核酸和蛋白質合成密切相關[1]，在分裂細胞中高度表達。血DAO活性的變化是反映小腸黏膜結構和功能狀況的較理想指標[2]。我們根據 Kirsten 等[3]、Lorenz等[4]和 Hosoda等[5]介紹的方法，建立了雙試劑連續監測法測定血中DAO活性。

材料和方法

一、儀器與試劑

島津UV-VIS2450型紫外-可見吸收光譜儀，HITACHI 7600-020全自動生化分析儀，BECKMAN CX7全自動生化分析儀。1，4-丁二胺(腐胺)、DAO、還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、谷氨酸脫氫酶 (glutamic acid dehydrogenase，GLDH)、α-酮戊二酸、血紅蛋白、膽紅素均購自美國Sigma公司;乙二胺四乙酸二鈉購自Genview公司;醫用脂肪乳及其他試劑均為國產試劑。

二、試劑配制

1.100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液 精確稱取12.153 g Tris，加入1.0 mL 5 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，用1.0 mol/L HCl調pH 值至8.0，定容至1000 mL。

2.試劑Ⅰ 按各自相對分子質量和酶活性取量，用 Tris-HCl緩沖液配制 0.3 mmol/L ADP、1000 U/L LDH、3000 U/L GLDH、5 mmol/L乙二胺四乙酸、10 mmol/L α-酮戊二酸溶液。

3.試劑Ⅱ 準確稱取0.2668 g 1，4-丁二胺溶于 1000 mL Tris-HCI緩沖液中，濃度為3.2 mmol/L;0.25 mmol/L NADH。

三、研究對象

選擇2006年1月至2009年12月在天津市第四醫院燒傷病房住院的嚴重燒傷患者30例。所有患者燒傷早期均接受正規休克復蘇治療，休克期度過平穩，手術及創面換藥按常規進行，于傷后第2天抽取靜脈血，分離血清于－80℃冷凍保存備用。

從健康體檢人群中選取臨床診斷基本正常，肝功能、腎功能、血脂均正常，無腸道疾病的健康體檢者150名，年齡18～55歲，男、女各75名，女性均為非妊娠期。采集靜脈血，分離血清，－80℃冷凍保存備用。

四、方法

1.DAO的測定原理 利用DAO催化1，4-丁二胺產生H2O2和NH3，NADH、NH3和α-酮戊二酸在GLDH作用下，生成NAD+和谷氨酸，NADH在340 nm處有特異吸收峰，其被氧化的速率與血清DAO活性呈正比，測定NADH下降速率，即可測出DAO活性。反應方程式:1，4-丁二胺+O2+H2OR-CHO+NH3+H2O2;NH3+α-酮戊二酸+NADH+谷氨酸+NAD++H2O。被檢樣本與試劑Ⅰ作用一定時間后，可將內源性1，4-丁二胺和NH3消耗掉，再加入試劑Ⅱ測定。此設計方法排除了內源性干擾，保證了DAO測定的準確性。

2.吸收光譜范圍測定 試劑Ⅰ和試劑Ⅱ按4∶1混合后，加入30 U/L DAO標準液于37℃反應3～5 min，用島津UV-VIS2450紫外-可見吸收光譜儀進行波長掃描，測定吸收光譜。

3.最佳檢測時間的確定 試劑Ⅰ和試劑Ⅱ按4∶1混合后，加入30 U/L DAO標準液于37℃反應，用島津UV-VIS2450紫外-可見吸收光譜儀檢測0～600 s的吸光度(A)值變化率，找出A值穩定變化時間范圍，即為最佳檢測時間。

4.最適Tris-HCl緩沖液濃度與pH值選擇對不同濃度的Tris-HCl緩沖液(分別為50、100、200、500 mmol/L)和 pH 值(分別為 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)與高濃度 DAO 臨床樣本進行測定，觀察DAO在不同濃度的緩沖液和pH條件下的活性變化，找出最佳緩沖液濃度和pH值。

5.最佳底物濃度選擇 用100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 值8.0)制成不同濃度1，4-丁二胺溶液(0～8.0 mmol/L)，對臨床高值血清中DAO進行測定。按雙倒數做圖法求得DAO的Km值，最佳底物濃度為Km值的10～20倍。

五、方法學評價

1.線性范圍 取DAO分別配制成2.5、5.0、10、20、40、80、100、160、240 U/L，在全自動生化分析儀上進行測定，繪制標準曲線，得出線性范圍。

2.精密度試驗 選用10、30、50 U/L DAO標準液，1 d內連續測定20次，計算批內精密度;每天不同濃度各測2次，連續測定20 d，取其均值計算批間精密度。

3.回收試驗 取DAO活性為10和30 U/L的臨床血樣本0.9 mL，各加入0.1 mL蒸餾水作為基礎樣本Ⅰ和Ⅱ;加入0.1 mL 100 U/L DAO標準品混合作為回收樣本Ⅰ和Ⅱ，測定其實測值與理論值的差異，計算回收率。

4.干擾試驗 按干擾物體積與血清樣本體積比為1∶9向臨床高值混合血清(24 U/L)中加入不同濃度的干擾物，使其樣本中干擾物終濃度分別為膽紅素:50、100、150、200 μmol/L;血紅蛋白:0.5、1、2、3、4、5 g/L;脂肪乳:2、3、4、5、6 g/L;NH4+:40、60、80、100、150 μmol/L;單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO):40、60、80、100、120、140 U/L。每份樣本重復測定2次，取其均值與理論值做比較，其干擾變異系數(CV)＜5%為無干擾。

5.試劑穩定性試驗 將試劑Ⅰ和Ⅱ分別置于HITACHI 7600-020全自動生化分析儀和BECKMAN CX7全自動生化分析儀試劑倉中，連續觀察4周10和30 U/L兩水平DAO標準液測量值的變化。同時在BECKMAN CX7全自動生化分析儀上進行試劑空白監測，以試劑空白＜0.5為試劑失效。

6.樣本穩定性 將3例血液樣本分別放置于室溫、4℃和－80℃保存，觀察不同儲藏溫度對樣本中DAO穩定性的影響。同時還觀察了反復凍融對3個不同濃度DAO的影響。

7.診斷準確度 選取30份燒傷后出現胃腸道黏膜屏障功能障礙或衰竭的燒傷患者樣本和30份正常對照者樣本，用本法測定血清DAO活性，采用受試者工作特征(receiver operating charateristic，ROC)曲線評價診斷準確度。

8.參考區間 測定150名健康體檢者DAO活性濃度，按95%可信區間確立參考區間。

六、統計學方法

結 果

一、方法建立

1.光譜掃描結果 DAO試驗反應的特異吸收峰值與反應原理中NADH的特異吸收峰值一致，均為340 nm。因此本法檢測波長為340 nm，副波長選擇405～410 nm以排除試驗干擾。見圖1。

2.最佳檢測時間的確定 圖2顯示200～300 s曲線近似水平，△A變化率穩定，故選為最佳檢測時間。

圖1 DAO試驗反應波長掃描

圖2 DAO試驗反應△A變化率-經時曲線

3.最佳緩沖液濃度與pH值選擇 高濃度DAO測定值在緩沖液濃度為100 mmol/L、pH值8.0時最大。因此以100 mmol/L、pH值8.0為最佳緩沖液濃度及pH值。結果見表1。

表1 不同緩沖液濃度與pH值條件下測定結果(U/L)

4.最佳底物濃度選擇 根據實測結果做圖可看出當底物濃度＞3.2 mmol/L時A值變化不大，反應幾乎為最大速度，說明反應已達零級反應。臨床樣本實測底物最佳濃度為3.2 mmol/L。根據Mjehaelis-Menten方程做雙倒數曲線，計算求得Km=0.15。最佳底物濃度應為Km的10～20倍，與臨床樣本實測底物最佳濃度相近似。見圖3。

圖3 底物濃度與酶促反應

二、方法學評價

1.線性范圍 本法線性范圍為0～100 U/L。見圖4。

圖4 DAO測定的線性范圍

2.精密度試驗 高值(50 U/L)、中值(30 U/L)及低值(10 U/L)3個水平的批內和批間精密度均＜5%，本法重復性良好。見表2。

3.回收試驗 2個水平的回收率分別為98.0%、95.8%，說明本法準確度較高。見表3。

表2 精密度試驗結果

表3 回收試驗結果

4.干擾試驗 膽紅素 ＜150 μmol/L、血紅蛋白 ＜4 g/L、脂肪乳 ＜4 g/L、NH4+＜ 60 μmol/L、MAO＜120 U/L時對本法無明顯干擾。見表4。

表4 干擾試驗結果

5.試劑穩定性 檢測結果以CV＜10%為限，試劑在BECKMAN CX7全自動生化分析儀上可穩定保存3周，在日立HITACHI 7600-020全自動生化分析儀上可穩定保存2周;以試劑空白A值＞0.5A為限，試劑可在BECKMAN CX7全自動生化分析儀上可保存3周。

6.樣本穩定性 樣本置4℃可保存1周，－80℃可保存6個月，反復凍融對反應結果有影響。

7.診斷準確度 ROC曲線下面積為0.960(在非參數假設下標準誤=0.022;在零假設下漸進Sig=0.000;漸近 95% 可信區間:0.913～1.000)。表明本法的診斷準確度良好。見圖5。

圖5 ROC曲線分析

8.參考區間 150名健康對照者血清DAO活性為(3.90±2.96)U/L，按 95%可信區間其診斷參考區間為0～9.7 U/L。

討 論

DAO是一種有脫胺作用的細胞內氧化酶，主要存在于哺乳動物小腸黏膜、胎盤絨毛和腎組織中，其中95%以上存在于小腸黏膜或絨毛上皮細胞，其分解代謝組胺等多胺物質與細胞核酸和蛋白合成密切相關，具有高度活性[1]。DAO對1，4-丁二胺和戊二胺具有專屬特異催化作用，MAO對其幾乎無催化作用，所以反應催化底物選用1，4-丁二胺。NADH、NH3和α-酮戊二酸在 GLDH催化下產生NAD+的反應，已在其他成熟生化反應體系中應用，如尿素檢測，所以反應監測指示物選用NADH。本研究用雙試劑連續監測法測定DAO，能消除內源性NH3和1，4-丁二胺的干擾，提高了對溶血、黃疸、脂血等樣本的抗干擾能力，增強了試劑在機穩定性，優于單試劑法、終點法和酶聯免疫吸附試驗。本法檢測DAO可直接反映酶的催化活性，而非酶的抗原表位含量，在反映酶的催化功能方面優于放射同位素標記測定法、熒光法、酶聯免疫吸附試驗等免疫學檢測法。

方法學評價顯示本方法準確度、精密度、線性良好，抗干擾能力強，但易受樣本中甘油三酯的影響，故樣本應避免脂血。本研究通過觀察試劑空白值和標準品測定值的變化聯合評價試劑穩定性，分析結果得出影響試劑有效性的主要因素為試劑中NADH的穩定性。為使試劑更穩定和易于保存，配制試劑時應加入EDTA和酶穩定劑。另外，某些重金屬離子和硫基化合物皆能抑制DAO[7]，故配制試劑時應注意排除該類物質。試劑在不同儀器上的穩定性有差異，這與儀器的試劑在機貯存溫度、制冷方式及試劑容器取樣孔的大小相關。本法適用于全自動生化儀，可對單個樣本進行實時檢測，為急癥和重癥患者提供準確的臨床報告。不同方法所測得酶含量和酶活性有差異，應建立自己實驗室的參考區間，以供臨床使用。

目前臨床用于腸道檢查的內窺鏡和放射顯影技術，只能觀察到腸道及其黏膜大體結構變化，而血清DAO檢測在細胞水平層面上，可無創傷性地反映腸黏膜結構和功能的損傷、修復情況。血清DAO活性在各種原因導致的腸黏膜損傷、妊娠早期是否正常和胎兒成熟度監測均有臨床意義。有研究顯示組織或體液中DAO活性升高還見于某些惡性腫瘤[6]，但惡性腫瘤患者血中DAO的檢測尚缺乏報道。本法測定DAO適于臨床推廣。由于本研究病種和病例數有限，對DAO與臨床其他疾病的關系有待進一步觀察和研究。

[1]Thompson JS，Vaughan WP，Forst CF，et al.The effect of the route of nutrient delivery on gut structure and diamine oxidase levels[J].JPEN J Parenter Enteral Nutr，1987，11(1):28-32.

[2]黎君友，呂 藝，付小兵，等.二胺氧化酶在創傷后腸道損傷中變化及意義[J].中華危重病急救醫學，2000，12(8):482-484.

[3]Kirsten E，Gerez C，Kirsten R.An enzymatic microdetermination method for ammonia，specifically for extracts of animal tissues and fluids.Determination of NH4 ions in blood[J].Biochem Z，1963，337:312-319.

[4]Lorenz W，Kusche J，Werle E.On a new method for the determination of diamine oxidase activity[J].Hoppe Seylers Z Physiol Chem，1967，348(5):561-567.

[5]Hosoda N，Nishi M，Nakagawa M，et al.Structural and functional alterations in the gut of parenterally or enterally fed rats[J].J Surg Res，1989，47(2):129-133.

[6]楊山鐘.二胺氧化酶放射化學法測定及其臨床應用[J].南京鐵道醫學院學報，1993，34(4):246-249.

[7]George G.Guilbault methods of enzymatic analysis translated by Miao huinan[M].Shanghai:Shanghai Science and Technology of Shanghai Press，1983:88-89.