雙試劑速率法測定二胺氧化酶活性的研究

胡進訪，吳 雁，王白石，王 旭

(1.天津市泰達醫(yī)院檢驗科，天津 300457;2.天津醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，天津 300203)

二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO，E.C.1.4.3.6)是人和哺乳動物小腸黏膜絨毛和胎盤絨毛中具有高度活性的細胞內(nèi)酶，在二胺(組胺、腐胺和尸胺)代謝中起催化作用，其與腸黏膜細胞核酸和蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)[1]，在分裂細胞中高度表達。血DAO活性的變化是反映小腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能狀況的較理想指標[2]。我們根據(jù) Kirsten 等[3]、Lorenz等[4]和 Hosoda等[5]介紹的方法，建立了雙試劑連續(xù)監(jiān)測法測定血中DAO活性。

材料和方法

一、儀器與試劑

島津UV-VIS2450型紫外-可見吸收光譜儀，HITACHI 7600-020全自動生化分析儀，BECKMAN CX7全自動生化分析儀。1，4-丁二胺(腐胺)、DAO、還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、谷氨酸脫氫酶 (glutamic acid dehydrogenase，GLDH)、α-酮戊二酸、血紅蛋白、膽紅素均購自美國Sigma公司;乙二胺四乙酸二鈉購自Genview公司;醫(yī)用脂肪乳及其他試劑均為國產(chǎn)試劑。

二、試劑配制

1.100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液 精確稱取12.153 g Tris，加入1.0 mL 5 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，用1.0 mol/L HCl調(diào)pH 值至8.0，定容至1000 mL。

2.試劑Ⅰ 按各自相對分子質(zhì)量和酶活性取量，用 Tris-HCl緩沖液配制 0.3 mmol/L ADP、1000 U/L LDH、3000 U/L GLDH、5 mmol/L乙二胺四乙酸、10 mmol/L α-酮戊二酸溶液。

3.試劑Ⅱ 準確稱取0.2668 g 1，4-丁二胺溶于 1000 mL Tris-HCI緩沖液中，濃度為3.2 mmol/L;0.25 mmol/L NADH。

三、研究對象

選擇2006年1月至2009年12月在天津市第四醫(yī)院燒傷病房住院的嚴重燒傷患者30例。所有患者燒傷早期均接受正規(guī)休克復蘇治療，休克期度過平穩(wěn)，手術(shù)及創(chuàng)面換藥按常規(guī)進行，于傷后第2天抽取靜脈血，分離血清于－80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

從健康體檢人群中選取臨床診斷基本正常，肝功能、腎功能、血脂均正常，無腸道疾病的健康體檢者150名，年齡18～55歲，男、女各75名，女性均為非妊娠期。采集靜脈血，分離血清，－80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

四、方法

1.DAO的測定原理 利用DAO催化1，4-丁二胺產(chǎn)生H2O2和NH3，NADH、NH3和α-酮戊二酸在GLDH作用下，生成NAD+和谷氨酸，NADH在340 nm處有特異吸收峰，其被氧化的速率與血清DAO活性呈正比，測定NADH下降速率，即可測出DAO活性。反應方程式:1，4-丁二胺+O2+H2OR-CHO+NH3+H2O2;NH3+α-酮戊二酸+NADH+谷氨酸+NAD++H2O。被檢樣本與試劑Ⅰ作用一定時間后，可將內(nèi)源性1，4-丁二胺和NH3消耗掉，再加入試劑Ⅱ測定。此設(shè)計方法排除了內(nèi)源性干擾，保證了DAO測定的準確性。

2.吸收光譜范圍測定 試劑Ⅰ和試劑Ⅱ按4∶1混合后，加入30 U/L DAO標準液于37℃反應3～5 min，用島津UV-VIS2450紫外-可見吸收光譜儀進行波長掃描，測定吸收光譜。

3.最佳檢測時間的確定 試劑Ⅰ和試劑Ⅱ按4∶1混合后，加入30 U/L DAO標準液于37℃反應，用島津UV-VIS2450紫外-可見吸收光譜儀檢測0～600 s的吸光度(A)值變化率，找出A值穩(wěn)定變化時間范圍，即為最佳檢測時間。

4.最適Tris-HCl緩沖液濃度與pH值選擇對不同濃度的Tris-HCl緩沖液(分別為50、100、200、500 mmol/L)和 pH 值(分別為 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)與高濃度 DAO 臨床樣本進行測定，觀察DAO在不同濃度的緩沖液和pH條件下的活性變化，找出最佳緩沖液濃度和pH值。

5.最佳底物濃度選擇 用100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 值8.0)制成不同濃度1，4-丁二胺溶液(0～8.0 mmol/L)，對臨床高值血清中DAO進行測定。按雙倒數(shù)做圖法求得DAO的Km值，最佳底物濃度為Km值的10～20倍。

五、方法學評價

1.線性范圍 取DAO分別配制成2.5、5.0、10、20、40、80、100、160、240 U/L，在全自動生化分析儀上進行測定，繪制標準曲線，得出線性范圍。

2.精密度試驗 選用10、30、50 U/L DAO標準液，1 d內(nèi)連續(xù)測定20次，計算批內(nèi)精密度;每天不同濃度各測2次，連續(xù)測定20 d，取其均值計算批間精密度。

3.回收試驗 取DAO活性為10和30 U/L的臨床血樣本0.9 mL，各加入0.1 mL蒸餾水作為基礎(chǔ)樣本Ⅰ和Ⅱ;加入0.1 mL 100 U/L DAO標準品混合作為回收樣本Ⅰ和Ⅱ，測定其實測值與理論值的差異，計算回收率。

4.干擾試驗 按干擾物體積與血清樣本體積比為1∶9向臨床高值混合血清(24 U/L)中加入不同濃度的干擾物，使其樣本中干擾物終濃度分別為膽紅素:50、100、150、200 μmol/L;血紅蛋白:0.5、1、2、3、4、5 g/L;脂肪乳:2、3、4、5、6 g/L;NH4+:40、60、80、100、150 μmol/L;單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO):40、60、80、100、120、140 U/L。每份樣本重復測定2次，取其均值與理論值做比較，其干擾變異系數(shù)(CV)＜5%為無干擾。

5.試劑穩(wěn)定性試驗 將試劑Ⅰ和Ⅱ分別置于HITACHI 7600-020全自動生化分析儀和BECKMAN CX7全自動生化分析儀試劑倉中，連續(xù)觀察4周10和30 U/L兩水平DAO標準液測量值的變化。同時在BECKMAN CX7全自動生化分析儀上進行試劑空白監(jiān)測，以試劑空白＜0.5為試劑失效。

6.樣本穩(wěn)定性 將3例血液樣本分別放置于室溫、4℃和－80℃保存，觀察不同儲藏溫度對樣本中DAO穩(wěn)定性的影響。同時還觀察了反復凍融對3個不同濃度DAO的影響。

7.診斷準確度 選取30份燒傷后出現(xiàn)胃腸道黏膜屏障功能障礙或衰竭的燒傷患者樣本和30份正常對照者樣本，用本法測定血清DAO活性，采用受試者工作特征(receiver operating charateristic，ROC)曲線評價診斷準確度。

8.參考區(qū)間 測定150名健康體檢者DAO活性濃度，按95%可信區(qū)間確立參考區(qū)間。

六、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、方法建立

1.光譜掃描結(jié)果 DAO試驗反應的特異吸收峰值與反應原理中NADH的特異吸收峰值一致，均為340 nm。因此本法檢測波長為340 nm，副波長選擇405～410 nm以排除試驗干擾。見圖1。

2.最佳檢測時間的確定 圖2顯示200～300 s曲線近似水平，△A變化率穩(wěn)定，故選為最佳檢測時間。

圖1 DAO試驗反應波長掃描

圖2 DAO試驗反應△A變化率-經(jīng)時曲線

3.最佳緩沖液濃度與pH值選擇 高濃度DAO測定值在緩沖液濃度為100 mmol/L、pH值8.0時最大。因此以100 mmol/L、pH值8.0為最佳緩沖液濃度及pH值。結(jié)果見表1。

表1 不同緩沖液濃度與pH值條件下測定結(jié)果(U/L)

4.最佳底物濃度選擇 根據(jù)實測結(jié)果做圖可看出當?shù)孜餄舛龋?.2 mmol/L時A值變化不大，反應幾乎為最大速度，說明反應已達零級反應。臨床樣本實測底物最佳濃度為3.2 mmol/L。根據(jù)Mjehaelis-Menten方程做雙倒數(shù)曲線，計算求得Km=0.15。最佳底物濃度應為Km的10～20倍，與臨床樣本實測底物最佳濃度相近似。見圖3。

圖3 底物濃度與酶促反應

二、方法學評價

1.線性范圍 本法線性范圍為0～100 U/L。見圖4。

圖4 DAO測定的線性范圍

2.精密度試驗 高值(50 U/L)、中值(30 U/L)及低值(10 U/L)3個水平的批內(nèi)和批間精密度均＜5%，本法重復性良好。見表2。

3.回收試驗 2個水平的回收率分別為98.0%、95.8%，說明本法準確度較高。見表3。

表2 精密度試驗結(jié)果

表3 回收試驗結(jié)果

4.干擾試驗 膽紅素 ＜150 μmol/L、血紅蛋白 ＜4 g/L、脂肪乳 ＜4 g/L、NH4+＜ 60 μmol/L、MAO＜120 U/L時對本法無明顯干擾。見表4。

表4 干擾試驗結(jié)果

5.試劑穩(wěn)定性 檢測結(jié)果以CV＜10%為限，試劑在BECKMAN CX7全自動生化分析儀上可穩(wěn)定保存3周，在日立HITACHI 7600-020全自動生化分析儀上可穩(wěn)定保存2周;以試劑空白A值＞0.5A為限，試劑可在BECKMAN CX7全自動生化分析儀上可保存3周。

6.樣本穩(wěn)定性 樣本置4℃可保存1周，－80℃可保存6個月，反復凍融對反應結(jié)果有影響。

7.診斷準確度 ROC曲線下面積為0.960(在非參數(shù)假設(shè)下標準誤=0.022;在零假設(shè)下漸進Sig=0.000;漸近 95% 可信區(qū)間:0.913～1.000)。表明本法的診斷準確度良好。見圖5。

圖5 ROC曲線分析

8.參考區(qū)間 150名健康對照者血清DAO活性為(3.90±2.96)U/L，按 95%可信區(qū)間其診斷參考區(qū)間為0～9.7 U/L。

討 論

DAO是一種有脫胺作用的細胞內(nèi)氧化酶，主要存在于哺乳動物小腸黏膜、胎盤絨毛和腎組織中，其中95%以上存在于小腸黏膜或絨毛上皮細胞，其分解代謝組胺等多胺物質(zhì)與細胞核酸和蛋白合成密切相關(guān)，具有高度活性[1]。DAO對1，4-丁二胺和戊二胺具有專屬特異催化作用，MAO對其幾乎無催化作用，所以反應催化底物選用1，4-丁二胺。NADH、NH3和α-酮戊二酸在 GLDH催化下產(chǎn)生NAD+的反應，已在其他成熟生化反應體系中應用，如尿素檢測，所以反應監(jiān)測指示物選用NADH。本研究用雙試劑連續(xù)監(jiān)測法測定DAO，能消除內(nèi)源性NH3和1，4-丁二胺的干擾，提高了對溶血、黃疸、脂血等樣本的抗干擾能力，增強了試劑在機穩(wěn)定性，優(yōu)于單試劑法、終點法和酶聯(lián)免疫吸附試驗。本法檢測DAO可直接反映酶的催化活性，而非酶的抗原表位含量，在反映酶的催化功能方面優(yōu)于放射同位素標記測定法、熒光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗等免疫學檢測法。

方法學評價顯示本方法準確度、精密度、線性良好，抗干擾能力強，但易受樣本中甘油三酯的影響，故樣本應避免脂血。本研究通過觀察試劑空白值和標準品測定值的變化聯(lián)合評價試劑穩(wěn)定性，分析結(jié)果得出影響試劑有效性的主要因素為試劑中NADH的穩(wěn)定性。為使試劑更穩(wěn)定和易于保存，配制試劑時應加入EDTA和酶穩(wěn)定劑。另外，某些重金屬離子和硫基化合物皆能抑制DAO[7]，故配制試劑時應注意排除該類物質(zhì)。試劑在不同儀器上的穩(wěn)定性有差異，這與儀器的試劑在機貯存溫度、制冷方式及試劑容器取樣孔的大小相關(guān)。本法適用于全自動生化儀，可對單個樣本進行實時檢測，為急癥和重癥患者提供準確的臨床報告。不同方法所測得酶含量和酶活性有差異，應建立自己實驗室的參考區(qū)間，以供臨床使用。

目前臨床用于腸道檢查的內(nèi)窺鏡和放射顯影技術(shù)，只能觀察到腸道及其黏膜大體結(jié)構(gòu)變化，而血清DAO檢測在細胞水平層面上，可無創(chuàng)傷性地反映腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷、修復情況。血清DAO活性在各種原因?qū)е碌哪c黏膜損傷、妊娠早期是否正常和胎兒成熟度監(jiān)測均有臨床意義。有研究顯示組織或體液中DAO活性升高還見于某些惡性腫瘤[6]，但惡性腫瘤患者血中DAO的檢測尚缺乏報道。本法測定DAO適于臨床推廣。由于本研究病種和病例數(shù)有限，對DAO與臨床其他疾病的關(guān)系有待進一步觀察和研究。

[1]Thompson JS，Vaughan WP，F(xiàn)orst CF，et al.The effect of the route of nutrient delivery on gut structure and diamine oxidase levels[J].JPEN J Parenter Enteral Nutr，1987，11(1):28-32.

[2]黎君友，呂 藝，付小兵，等.二胺氧化酶在創(chuàng)傷后腸道損傷中變化及意義[J].中華危重病急救醫(yī)學，2000，12(8):482-484.

[3]Kirsten E，Gerez C，Kirsten R.An enzymatic microdetermination method for ammonia，specifically for extracts of animal tissues and fluids.Determination of NH4 ions in blood[J].Biochem Z，1963，337:312-319.

[4]Lorenz W，Kusche J，Werle E.On a new method for the determination of diamine oxidase activity[J].Hoppe Seylers Z Physiol Chem，1967，348(5):561-567.

[5]Hosoda N，Nishi M，Nakagawa M，et al.Structural and functional alterations in the gut of parenterally or enterally fed rats[J].J Surg Res，1989，47(2):129-133.

[6]楊山鐘.二胺氧化酶放射化學法測定及其臨床應用[J].南京鐵道醫(yī)學院學報，1993，34(4):246-249.

[7]George G.Guilbault methods of enzymatic analysis translated by Miao huinan[M].Shanghai:Shanghai Science and Technology of Shanghai Press，1983:88-89.