原發性肝癌組織及細胞系中DNMT mRNA表達的檢測及意義

高 波，李海平，余宗濤，呂 軍，張吉才

(湖北醫藥學院附屬太和醫院檢驗科，湖北 十堰 442000)

我們既往的研究發現原發性肝癌組織中p16基因發生甲基化的頻率非常高，并且通過分組發現乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染相關肝癌的p16基因甲基化的頻率要高于非HBV相關肝癌，提示HBV的持續感染對p16基因的異常甲基化有一定作用，但其作用機制尚不明確[1-3]。基因的異常甲基化可能與多種因素有關，包括甲基化轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)水平、致癌物接觸、基因修復缺陷等，其中DNMT是調節甲基化的主要因素。為了解HBV感染與DNMT表達之間的關系，本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測44例原發性肝癌組織和HBV相關肝癌細胞系Hep3B、非HBV相關肝癌細胞系HepG2中4 種 DNMT mRNA(DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B)的表達情況，初步探討DNMT mRNA表達改變與HBV感染及肝癌等的關系。

材料和方法

一、臨床資料

收集太和醫院2010年12月1日至2012年2月1日的肝癌患者術后新鮮癌組織標本44例，患者男35例，女9例。所有組織標本均經病理學確診，臨床資料完整。組織標本收集后液氮中保存備用。根據患者血清中HBV標志物的存在與否，將癌組織分為2組。HBV相關性肝癌組:共32例，患者血液標本中至少檢測出一種HBV感染的標志物，HBsAg、HBeAg、抗 HBe、抗 HBc 或 HBV DNA;非HBV相關性肝癌組:血液標本中未檢測出任何一種HBV感染標志物，共12例。

二、細胞及主要儀器試劑

肝癌細胞系Hep3B和HepG2購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，來自于美國標準生物品收藏中心;細胞培養基DMEM、小牛血清均購于GIBCO公司;Trizol Reagent(Invitrogen公司);逆轉錄試劑盒(Promege公司);PCR試劑(上海生工公司);PCR儀PE7500(ABI公司);SYBR GreenⅠ染料(Gene公司);G-BOX紫外凝膠成像系統(Gene公司);ND-2000微量核酸定量儀(美國NanoDrop公司);150 bp DNA mark(上海生工公司);DNA mark(北京天根公司);TG-16WS臺式高速冷凍離心機(日立公司)。

三、方法

1.PCR引物設計與合成 DNMT1:5'-CGACTACATCAAAGGCAGCAACCTG-3'，5'-TGGAGTGGACTTGTGGGTGTTCTC-3'，擴增產物 166 bp;DNMT2:5'-AAGCTGTAAGCCAGCCCATATAC-3'，5'-TCAGCAGTGAACAGAACCTACATG-3'，擴增產物148 bp;DNMT3A:5'-CGAGTCCAACCCTGTGATGATTG-3'，5'-GCTGGTCTTTGCCCTGCTTTATG-3'，擴增產物221 bp;DNMT3B:5'-TTGGAATAGGGGACCTCGTGTG-3'，5'-AGAGACCTCGGAGAACTTGCCATC-3'，擴增產物 152 bp;GAPDH:5'-GAAGGTGAAGTCGGAGTC-3'，5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，擴增產物226 bp。所有引物合成由北京賽百盛公司完成。

2.細胞培養 人肝癌細胞株HepG2(HBsAg陰性)和Hep3B(HBV陽性)待復蘇后培養于含100 mL/L小牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的 DMEM培養液，培養在6孔培養板中，置于5%CO2的37℃的細胞培養箱，每3～4天消化傳代1次。培養結束時，先把培養液抽干，加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化細胞，置于37℃ 2 min后收集細胞，再以磷酸鹽緩沖液洗滌細胞備用。

3.癌組織及細胞總RNA提取 參照Trizol說明書提取細胞中總RNA。

4.逆轉錄 參照試劑盒說明書將總RNA逆轉錄為cDNA。

5.PCR擴增 按試劑盒要求操作。反應條件:95℃ 預變性3 min;95℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃1 min，共40個循環;最后一循環于72℃ 5 min。

6.結果判斷 基因相對定量方法:利用檢測得到的Ct值和計算得到的擴增效率，以參比基因(GAPDH)為內參，計算mRNA的相對表達量。R=Test mRNA/參比 mRNA=(1+E參比)Ct(參比)/(1+E)Ct(test)test

四、統計學方法

應用SPSS13.0統計軟件進行結果分析，計量資料經檢驗符合正態分布的，采用表示，采用兩獨立樣本t檢驗，以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、DNMT mRNA實時熒光定量PCR的建立

2種肝癌細胞系重復5次培養，收集細胞后提取總RNA，待濃度和純度符合要求后進行逆轉錄及PCR擴增，最后進行各個基因表達檢測，基因表達的結果用表示。檢測4種DNMT mRNA實時熒光定量PCR均具有比較好的特異性，熔點曲線見圖1。

二、4種DNMT mRNA在肝癌細胞系Hep3B與HepG2中的表達

Hep3B細胞系中 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表達高于 HepG2細胞系(P＜0.01)。見表1。

三、原發性肝癌患者肝癌組織DNMT mRNA表達的分析

HBV感染相關癌組織中 DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達水平明顯高于非HBV感染相關癌組織(P＜0.05)。見表2。

圖1 DNMT和GAPDH的熔點曲線

表1 2株肝癌細胞系中DNMT mRNA的表達 (R)

表2 肝癌組織中DNMT mRNA的表達分析

討 論

至今發現的DNMT至少有4種亞型，分別為:DNMT1、DNMT2、DNMT3A 和 DNMT3B，主要功能是維持甲基化和全程甲基化。甲基化是在DNMT的催化作用下加到C上形成mC[4]，從理論上講應與DNMT的結構和/或活性異常有關。DNMT1的主要功能是保證新合成的DNA具有高度的保真性，并且維持甲基化轉移酶的功能[5]。DNMT2的作用目前尚不明確，可能與著絲粒區域的甲基化控制有關。DNMT3A和DNMT3B在原始胚胎形成中起重要的作用，主要功能是催化DNA甲基化的新生位點。正常細胞DNMT1的過度表達可導致CpG島超甲基化，促進細胞轉化。有研究表明，部分腫瘤細胞的DNMT水平表達明顯高于正常細胞，并且與某些抑癌基因的超甲基化狀態相關[6]。在細胞周期中不同的 DNMT mRNA可能受不同的調節機制調控，異常的DNMT表達可引起甲基化改變，且DNMT功能改變可引起異常甲基化或正常甲基化模式的丟失，導致DNA甲基化模式的轉換。與DNMT相關的因素可能有:(1)與DNMT1忠誠性有關;(2)與 DNMT3A和DNMT3B的錯誤靶向有關;(3)與錯誤的甲基化修復機制有關;(4)與DNMT的活性異常有關;(5)與染色質構型重塑(chromatin remodeling)有關。

HBV感染與肝癌之間的關系十分密切，流行病學調查發現肝癌患者 HBsAg陽性率可達90%[7]。國內外的研究也表明持續的HBV感染所導致的部分抑癌基因甲基化是肝癌發生、發展過程中的早期事件[3，8-9]。雖然持續的HBV感染可以導致部分抑癌基因的甲基化發生，但是這其中的機制尚不明確。本研究采用定量PCR檢測HBV相關性與非HBV相關性肝癌細胞系中4種DNMT mRNA表達水平的變化，探討HBV感染是否對一種或多種DNMT mRNA的表達水平產生影響。

在本結果中發現HBV感染肝癌組織和非HBV感染肝癌組織間DNMT mRNA表達水平不同。HBV感染相關肝癌組織中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA水平明顯高于非HBV感染相關癌組織，還發現可分泌HBsAg的Hep3B細胞這3種 DNMT mRNA表達也高于 HBsAg陰性的HepG2細胞。上述試驗結果表明HBV的病毒組分可以剌激受染細胞DNMT mRNA的表達，進而促進抑癌基因的甲基化。甲基化酶的表達異常改變可能與基因異常甲基化和腫瘤形成有關，在多種腫瘤中均可見DNMT mRNA的過度表達。國內許軍等[10]在研究人肝癌細胞株、人正常肝細胞株及癌旁細胞株中DNMT3B的表達發現，肝癌細胞株中DNMT3B mRNA的表達要明顯高于正常和癌旁細胞株，提示DNMT3B的高表達可能與肝癌的發生相關。

病毒感染與DNMT之間的這種關系并不只存在于肝癌細胞中。有研究表明除HBV外的其他病毒及其組分也可通過激活DNMT的活性從而進一步使抑癌基因的表達下降。Tsai等[11]在培養的鼻咽癌細胞系中發現，經過EB病毒感染的癌基因產物(LMP-1)能夠誘導 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表達，進而使E-cadherin基因發生甲基化。EB病毒是胃癌發生的一個潛在危險因子，研究發現，在胃癌發生過程中，DNMT1的高表達與 h-MLH、thrombospondin-1、E-cadherin等基因啟動子甲基化和CpG島甲基化表型相關，并且這些基因的甲基化均與EB病毒感染有關[12]。HB病毒感染、DNMT活性改變、基因甲基化都是肝癌形成的早期事件，那么從某種程度上講，三者具有潛在的關聯，HBV感染作為肝癌形成的一個外部生物因子，可能通過刺激DNMT基因的表達，進而促進抑癌基因甲基化而參與肝癌形成，這也為了解肝癌的發生機制提供了一個新的思路。

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