骨髓增生異常綜合征患者SALL4和Nanog的表達(dá)及其臨床意義

丁柳美，黃紅梅，高 松，鄔揚(yáng)炯，李 瑩，化范例

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201508;2.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院血液科，上海 201508)

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一組獲得性造血干細(xì)胞克隆性疾病，以血細(xì)胞減少及病態(tài)造血為特點(diǎn)，但MDS異質(zhì)性非常明顯，大部分患者呈現(xiàn)慢性、良性的病程，而高危患者可轉(zhuǎn)化為急性白血病，預(yù)后極差。促進(jìn)MDS轉(zhuǎn)化為急性白血病的機(jī)制未明，近年來研究表明，同源異型基因SALL4表達(dá)失衡可增加CD34+造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的增殖能力而促進(jìn)白血病的發(fā)生[1]，另外一種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Nanog則抑制p53表達(dá)并與正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)[2-3]。MDS作為“白血病前期”，造血干細(xì)胞具有不斷演變的特點(diǎn)，本研究對各亞型MDS患者外周血及骨髓有核細(xì)胞SALL4 mRNA和Nanog mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，以初步探討MDS患者SALL4 mRNA和Nanog mRNA表達(dá)的臨床意義。

材料和方法

一、標(biāo)本來源

標(biāo)本來源于復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院腫瘤血液中心2007年6月至2012年6月收治的75例MDS患者。所有患者均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)或分子生物學(xué)確診，按2008年第4版《WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues》重新確認(rèn)分型，其中難治性血細(xì)胞減少伴單系病態(tài)造血(RCUD)11例，難治性貧血伴環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞(RAS)2例，難治性血細(xì)胞減少伴多系發(fā)育異常(RCMD)29例，難治性貧血伴原始細(xì)胞增多(包括RAEB-I和 RAEBII)28例，不能分類者(MDS-U)5例。男41例，女34例，年齡21～76歲。對照組30名，男18名，女12名，年齡31～59歲，為健康體檢人群。

二、試劑和儀器

Trizol試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，紅細(xì)胞裂解液購自無錫碧云天生物試劑公司，Prime-Script RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒均購自日本Takara公司，熒光定量PCR儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品(MasterCycler Realplex4 system)。引物由Invitrogen公司合成。

三、外周血和骨髓標(biāo)本制備

外周血標(biāo)本:抽取靜脈血2 mL，置經(jīng)乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acide，EDTA)處理的15 mL無酶離心管內(nèi);骨髓標(biāo)本:抽取2～3 mL骨髓，立即置經(jīng)EDTA處理的15 mL無酶離心管內(nèi)。于30 min內(nèi)進(jìn)行以下操作:在離心管內(nèi)加入3 mL紅細(xì)胞裂解液，輕輕振蕩混勻后靜置10 min，室溫470×g離心5 min，棄上清。重復(fù)裂解紅細(xì)胞1次，加入1 mL Trizol試劑置－70℃保存以備提取總RNA。

四、總RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄PCR

采用 Trizol-氯仿-異丙醇方法提取標(biāo)本總RNA，所提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度儀測定總RNA含量及260和280 nm處吸光度(A)值，260和280 mm A值在1.80以上者用于后續(xù)試驗(yàn)。每份標(biāo)本取總 RNA 1 μg，按照產(chǎn)品操作說明，以20 μL體系逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。

熒光定量 PCR:登陸 GenBank查詢 SALL4 cDNA序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)各目的基因擴(kuò)增引物，SALL4上游引物 5'-CAGCACATCAACTCGGAGGAGGAGG-3'，下游引物 5'-ACTCAGAGATGCTGAAGAACTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物282 bp;Nanog上游引物5'-CAGCTGTGTGTACTCAATGATAGA-3'，下游引物5'-ACACCATTGCTATTCTTCGGCCAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物179 bp;內(nèi)參GAPDH上游引物 5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'，下游引物 5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物127 bp。反應(yīng)條件為95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為20 μL，每份標(biāo)本均設(shè)3孔檢測。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。mRNA表達(dá)變化以ΔΔCt作為統(tǒng)計(jì)量，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)2組內(nèi)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組內(nèi)比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)則進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。分類資料比較采用χ2檢驗(yàn)。SALL4 mRNA和Nanog mRNA表達(dá)(ΔΔCt)關(guān)系進(jìn)行線性相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MDS患者SALL4 mRNA和Nanog mRNA表達(dá)

30名正常對照外周血有核細(xì)胞均無SALL4表達(dá)，75例MDS患者中，39例外周血有不同強(qiáng)度的SALL4表達(dá)，有36例SALL4不表達(dá)。MDS患者SALL4表達(dá)明顯高于正常對照(χ2=22.92，P＜0.01)。MDS患者骨髓標(biāo)本的SALL4表達(dá)明顯高于外周血標(biāo)本(Z=5.60，P ＜0.01)，所有 MDS 患者骨髓中均可見SALL4表達(dá)。75例MDS患者及正常對照外周血均可見Nanog表達(dá)，但各亞型MDS患者表達(dá)明顯高于正常對照(F=88.78，P＜0.01)。而且，MDS患者Nanog在骨髓中的表達(dá)水平與外周血基本相仿(t=0.898，P=0.371)，見圖1。

圖1 MDS患者SALL4 mRNA和Nanog mRNA的表達(dá)

二、MDS各亞型之間SALL4 mRNA和Nanog mRNA的表達(dá)

MDS各亞型之間在外周血和骨髓中的SALL4與Nanog表達(dá)均有明顯差異，見圖2。其中外周血有核細(xì)胞SALL4的表達(dá)幾乎均局限于RAEB-Ⅰ和RAEB-Ⅱ2 個(gè)亞型，其余亞型少見表達(dá)(χ2=43.59，P＜0.01);骨髓中SALL4表達(dá)在各亞型之間同樣差異明顯(F=15.98，P ＜0.01);外周血和骨髓中Nanog的表達(dá)在不同MDS亞型患者之間均差異明顯(外周血 F=27.47，P ＜ 0.01;骨髓 F=23.92，P ＜0.01)，以RAEB-Ⅰ和 RAEB-Ⅱ2 個(gè)亞型患者表達(dá)最強(qiáng)。另外，SALL4與Nanog在骨髓中的表達(dá)呈現(xiàn)一定的相關(guān)性(r=0.58，P ＜0.01)。

圖2 SALL4 mRNA和Nanog mRNA在MDS各亞型之間的表達(dá)

三、SALL4 mRNA和 Nanog mRNA表達(dá)與MDS的轉(zhuǎn)歸

75例MDS患者中，共有7例患者轉(zhuǎn)化為急性髓性白血病，其中5例為 RAEB-Ⅱ亞型，1例為RAEB-Ⅰ亞型，另外1例為RCMD亞型。雖然例數(shù)較少，但這些患者無論是外周血還是骨髓，其SALL4 mRNA和Nanog mRNA的表達(dá)均高于其他患者(SALL4 外周血 t=2.27，P ＜0.05;骨髓 t=2.85，P ＜0.05。Nanog 外周血 t=5.20，P ＜0.01;骨髓 t=5.51，P ＜0.01)。

討 論

原癌基因SALL4是一類在進(jìn)化過程中高度保守的基因。在正常骨髓CD34+造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞中表達(dá)，而隨原始細(xì)胞的分化成熟，其表達(dá)下調(diào)，對維持胚胎干細(xì)胞的多向潛能和自我更新有著重要作用[2]。SALL4作為調(diào)節(jié)生長發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，可與其他造血調(diào)控因子共同作用于造血過程，影響白血病的發(fā)生和發(fā)展。本研究對SALL4與血液病中MDS的關(guān)系進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示MDS患者SALL4表達(dá)明顯高于正常對照，但有部分患者外周血始終未能誘導(dǎo)出SALL4表達(dá)，而患者骨髓中則均表達(dá)SALL4且明顯高于外周血標(biāo)本。由此可見，SALL4在外周血表達(dá)量較小，而骨髓由于含有較多的造血干細(xì)胞，對SALL4檢測的敏感性明顯增高。Lin等[3]最新的研究表明，MDS患者SALL4表達(dá)的升高可能源于基因的低甲基化。

2003 年，Chambers等[4]和 Mitsui等[5]幾乎同時(shí)報(bào)道了一種在囊胚內(nèi)細(xì)胞群、原始生殖細(xì)胞以及ESCs表達(dá)的新轉(zhuǎn)錄因子，將該基因命名為Nanog。Nanog除了有助于胚胎干細(xì)胞自我更新和維持其未分化狀態(tài)，還可促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]。Nanog在癌細(xì)胞中的表達(dá)及其與p53之間的相互作用提示Nanog的表達(dá)與體細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)[7]。我們通過對Nanog在MDS中的變化以及其在疾病不同狀態(tài)下的表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)雖然Nanog的表達(dá)方式與SALL4有所區(qū)別，但其表達(dá)亦明顯高于正常對照，表明Nanog和SALL4在MDS的發(fā)生、發(fā)展中同樣密切相關(guān)。SALL4與Nanog在骨髓中的表達(dá)量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，提示在MDS疾病的發(fā)展過程中，SALL4與Nanog具有同步變化的特點(diǎn)，二者可能共同參與了促進(jìn)造血干細(xì)胞惡變的機(jī)制。

無論是在外周血和骨髓中，SALL4和Nanog的表達(dá)在MDS各亞型之間均存在明顯差異:RAEB-I和RAEB-Ⅱ 2個(gè)亞型中Nanog和SALL4的表達(dá)明顯高于其他亞型，這與 RAEB-I和RAEB-II亞型體內(nèi)原始細(xì)胞數(shù)量明顯升高相一致。王華等[8]運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄PCR已經(jīng)證實(shí)急性白血病患者高表達(dá)SALL4，其中以急性髓性白血病患者表達(dá)更為明顯，而本研究相應(yīng)地發(fā)現(xiàn)，在7例轉(zhuǎn)化為急性髓性白血病的MDS患者中，其確診MDS時(shí)的外周血及骨髓的SALL4和Nanog表達(dá)明顯高于其他患者，提示MDS患者中Nanog和SALL4的表達(dá)可能從另外一個(gè)側(cè)面反映白血病細(xì)胞的負(fù)荷，對疾病的轉(zhuǎn)歸具有一定的預(yù)測意義。SALL4和Nanog均與正常造血干細(xì)胞向白血病干細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，二者是否具有協(xié)同作用有待于進(jìn)一步研究。深入了解SALL4和Nanog的作用將有助于探討MDS的發(fā)病機(jī)制及其各亞型之間在分子生物學(xué)水平上的差別，并為今后更準(zhǔn)確地診斷和靶向治療惡性血液病提供潛在的新途徑。

[1]Yang J，Liao W，Ma Y.Role of SALL4 in hematopoiesis[J].Curr Opin Hematol，2012，19(4):287-291.

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[3]Lin J，Qian J，Yao DM，et al.Aberrant hypomethylation of SALL4 gene in patients with myelodysplastic syndrome[J].Leuk Res，2013，37(1):71-75.

[4]Chambers I，Colby D，Robertson M，et al.Functional expression cloning of Nanog，a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells[J].Cell，2003，113(5):643-655.

[5]Mitsui K，Tokuzawa Y，Itoh H，et al.The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells[J].Cell，2003，113(5):631-642.

[6]Chambers I，Colby D，Robertson M，et al.Functional expression cloning of Nanog，a pluripotency sustainingfactor in embryonic stem cells[J].Cell，2003，113(5):643-655.

[7]Lin T，Chao C，Saito S，et al.p53 induces differentiation of mouse embryonic stem cells by suppressing Nanog expression[J].Nat Cell Biol，2005，7(2):165-171.

[8]王 華，譚 獲，劉 芳，等.RT-PCR檢測 SALIA4基因在白血病中的表達(dá)[J].臨床血液學(xué)雜志，2008，21(6):600-602.