同位素稀釋質譜法、酶法和堿性苦味酸法測定血清肌酐方法比較

宋云霄， 歐美賢，李水軍，張海晨，余 琛

(1.上海市徐匯區中心醫院檢驗科，上海 200031;2.上海市徐匯區中心醫院中心實驗室，上海 200031)

血清肌酐是評價腎功能的重要指標。目前臨床常用的檢測方法有化學法和酶法，堿性苦味酸法(簡稱Jaffe法)和肌氨酸氧化酶法(簡稱酶法)是其代表方法，但均存在不同程度的特異性和可比性等問題[1-4]，國內實驗室肌酐的檢測性能還有待進一步提高[5]。建立參考方法是解決Jaffe法和酶法肌酐檢測問題的有效途徑。國際上肌酐檢測的參考方法采用同位素稀釋氣相色譜質譜法或者同位素稀釋液相色譜串聯質譜法(ID-LC-MS/MS)[6-9]。我們采用自建的 ID-LC-MS/MS，在方法學全面驗證之后，與酶法和Jaffe法進行比較，評價現有肌酐檢測方法與ID-LC-MS/MS的可比性。

材料和方法

一、試劑和儀器

1.試劑 肌酐標準品(純度99.8%)購自美國Sigma公司;肌酐-d3(同位素豐度98%)購自加拿大TRC公司;改良Jaffe法肌酐測定試劑盒(批號:141012017)、Jaffe法肌酐測定試劑盒(批號:141112011)、邁瑞常規生化復合校準品(批號:SM312)、邁瑞常規生化復合定值質控品(正常水平批號:050212003;病理水平批號:QMP313)均購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

2.儀器 ID-LC-MS/MS采用液相色譜串聯質譜系統，由 Agilent 1200液相色譜儀(美國Agilent公司)和API 4000串聯四極桿質譜儀(美國Applied Biosystems公司)組成。酶法和Jaffe法采用邁瑞BS-800M全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)。

二、肌酐檢測方法

1.ID-LC-MS/MS 在50 μL血清中添加同位素肌酐-d3為內標，用甲醇沉淀蛋白，離心取上清液，經高效液相色譜分離，以正離子多反應監測質譜掃描分析，檢測離子通道為114/86 amu(肌酐)和117/89 amu(內標)。方法的線性范圍為4.4～885 μmol/L(0.5 ～ 100 μg/mL)，最低定量限為4.4 μmol/L。尿毒癥標本及脂血、溶血、黃疸對肌酐分析無干擾。

2.酶法 采用邁瑞BS-800M全自動生化分析儀測定，波長為546 nm，溫度37℃，采用終點法分析類型，反應方向為上升反應。線性范圍為10 ～9000 μmol/L。取空白/校準品/標本 6 μL，加入肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、過氧化氫酶及 ESPMT混合物180 μL，混勻，37℃孵育5 min，測定吸光度(A1)值;再加入肌酐胺基水解酶、過氧化物酶及4-氨基安替比林(4-APP)的混合物 60 μL，混勻，37 ℃孵育 5 min后，測定A2值，計算A值的差值ΔA(ΔA=[(A2－A1)校準品管或標本管－ (A2－A1)空白管]。

3.Jaffe法 采用邁瑞BS-800M全自動生化分析儀測定，波長510 nm，溫度37℃，采用固定時間法分析類型，反應方向為上升反應。線性范圍為 9 ～2420 μmol/L。取空白/校準品/標本18 μL，加入 0.38 mol/L NaOH 180 μL，混勻，37℃孵育 1 min;再加入 15 mmol/L苦味酸180 μL，混勻，37 ℃孵育30 s后，連續測定2 min內的A值，計算變化率(ΔA/min=ΔA/min標本管－ΔA/min空白管)。

三、標本來源

收集上海市徐匯區中心醫院門診及住院患者血清標本共200例，其中男82例、女118例，排除明顯溶血和脂濁的標本。同時收集上海市徐匯區中心醫院門診、體檢中心及住院患者的臨床檢驗剩余標本，選擇明顯溶血標本50例、高脂標本(甘油三酯1.88～17.6 mmol/L)50例作為干擾標本。收集臨床男、女性正常血清標本各1份，分別添加50和100 μmol/L肌酐標準品，用于精密度和回收率試驗。所有血清標本收集后置－70℃保存。

四、精密度及回收率試驗

按美國臨床實驗室修正法案(CLIA'88)的要求觀察3種方法的精密度。批內精密度:一次性同時測定20次;批間精密度:每天2批，每批2個濃度，每個濃度檢測2次，連續測定10批。精密度以變異系數(CV)表示[CV(%)=重復測定結果標準差/均值 ×100]。添加50和100 μmol/L肌酐標準品的正常血清標本和未添加肌酐標準品的正常血清標本分別用 ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法重復測定6次，觀察方法的回收率。回收率(%)=(添加標準品標本的血清肌酐濃度－未添加標準品標本的血清肌酐濃度)/標準品添加濃度×100。

五、干擾試驗

分別用 ID-LC-MS/MS、酶法、Jaffe法測定溶血標本、高脂標本的肌酐濃度，計算酶法和Jaffe法與 ID-LC-MS/MS的相對偏差。方法偏差(Bias%)=(方法1測定值－方法2測定值)/[(方法1測定值+方法2測定值)/2]×100。考察溶血和脂血對3種方法檢測肌酐的影響。

六、統計學方法

數據統計分析采用SPSS 16.0軟件進行，方法之間的差異采用配對t檢驗和方差分析，方法相關性采用線性回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、精密度及回收率

3種方法重復測定血清肌酐的批內、批間精密度及回收率結果見表1。3種方法的批內、批間CV均＜5%，回收率由高到低依次為ID-LC-MS/MS＞酶法＞Jaffe法，無論添加50還是100 μmol/L肌酐標準品，3種方法回收率差異均有統計學意義(P ＜0.005)。

二、相關性和偏差

采用ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法分別測定200例臨床血清標本肌酐濃度，經線性回歸分析，方法間的回歸方程分別為Y酶法=0.964XID-LC-MS/MS+0.385，r=0.994;YJaffe法=0.955XID-LC-MS/MS+13.14，r=0.979。ID-LC-MS/MS 與酶法、Jaffe 法的線性相關圖見圖1。

表1 ID-LC-MS/MS、酶法、Jaffe法測定血清肌酐的精密度及回收率 (%)

圖1 ID-LC-MS/MS與酶法、Jaffe法的線性相關圖

對ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法檢測200例血清標本肌酐濃度進行方法之間的一致性分析。以2種方法的肌酐測定均值為橫坐標，以2種方法肌酐測量值百分偏差為縱坐標，做Bland-Altman圖分析酶法、Jaffe法與ID-LC-MS/MS的測定差異，見圖2。酶法與ID-LC-MS/MS的平均偏差為 －2.93%，偏差幅度在 －26.2% ～21.2%之間波動;測定偏差有濃度依賴關系，當肌酐濃度＞100 μmol/L時酶法的測定結果正負偏差和波動幅度明顯減小(相對偏差為 －8.3% ～2.4%)。Jaffe法與ID-LC-MS/MS的平均偏差為13.9%，偏差幅度在－12.6% ～35.5%之間波動。與IDLC-MS/MS相比，肌酐 ＜100 μmol/L時 Jaffe法的結果呈現明顯正偏差;肌酐＞100 μmol/L時Jaffe法結果與ID-LC-MS/MS基本趨于一致(相對偏差為 －3.7% ～14.6%)。從圖2可以看出酶法與ID-LC-MS/MS的肌酐測定結果總體上呈現較小的負偏差，而Jaffe法與ID-LC-MS/MS的肌酐測定結果呈明顯正偏差。

三、干擾試驗

同時用ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法測定高脂標本的血清肌酐濃度。結果顯示高脂可明顯干擾酶法及Jaffe法測定血清肌酐的準確性。與IDLC-MS/MS相比，酶法及Jaffe法的測定結果均出現負偏差，見圖3;酶法的平均百分偏差為－10.9%(－22.1% ～ 13.7%)，Jaffe 法 為－17.5%(－71.1% ～16.1%)。高脂對 Jaffe法的影響比酶法更大，其中有4份甘油三酯 ＞7.0 mmol/L的標本肌酐測定結果甚至出現負值。隨著甘油三酯濃度的增高，測定負偏差趨勢越明顯。

同時用ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法測定明顯溶血標本的肌酐濃度。與ID-LC-MS/MS比較，酶法測定溶血標本肌酐濃度的相對偏差均值為－9.1%(－18.0% ～11.7%)，Jaffe法的相對偏差均值為 －4.7%(－22.0% ～20.0%)。

高脂、溶血對酶法和Jaffe法測定肌酐產生明顯的負偏差，其百分偏差與正常標本比較有明顯差異(P ＜0.001)，見圖4。

圖2 ID-LC-MS/MS與酶法、Jaffe法的Bland-Altman圖

圖3 甘油三酯濃度與酶法-ID-LC-MS/MS、Jaffe法-ID-LC-MS/MS測定肌酐百分偏差的關系

圖4 正常標本、高脂標本和溶血標本肌酐測定偏差比較

討 論

隨著臨床檢驗實驗室檢測項目和檢測標本量的不斷增加，用于臨床檢驗的各種儀器和方法也越來越多。而不同方法之間是否具有可比性，不同醫院、實驗室之間檢測結果能否互認仍然是擺在我國臨床檢驗醫學面前的現實難題[10]。而進行方法比對試驗，特別是與參考標準方法進行比對，是實現檢驗結果一致性的重要途徑[11]。目前臨床測定血清肌酐的常用方法為酶法和Jaffe法，有很多報道表明2種方法測定肌酐存在差異[1，3，12]。同位素稀釋質譜法利用在標本中添加與肌酐結構相同的穩定同位素內標，標本處理后經液相色譜儀分離，多反應監測質譜選擇肌酐的母離子和子離子，檢測離子信號。本研究采用自建的ID-LC-MS/MS，在方法學全面驗證之后，對ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法血清肌酐檢測結果的可比性進行分析，為臨床實驗室不同檢測系統肌酐檢測結果的一致性提供參考。建立和應用參考方法是臨床檢驗標準化的有效途徑，參考方法經過了嚴格的溯源和驗證，具有最高的計量學溯源性和準確性。但是參考方法對儀器設備和分析條件的要求較高，常規實驗室難以實現，應用范圍窄。與國際推薦的參考方法相比，本研究自建的ID-LC-MS/MS在實驗室內部進行了評價和驗證，并與常規方法進行了比較，簡便性和適用性是其突出特點。

酶法測定血清肌酐具有良好的精密度，批內、批間 CV均 ＜1.14%，Jaffe法的 CV可控制在2.39%以內。相對酶法和Jaffe法，ID-LC-MS/MS需要進行標本前處理，但CV可控制在3.84%以內。可見3種方法分析精密度完全滿足臨床血清肌酐檢測的要求。在正常血清中添加2個濃度水平的肌酐標準品，測定肌酐的回收率，平均回收率由高到低分別為ID-LC-MS/MS＞酶法＞Jaffe法，表明ID-LC-MS/MS在降低基質干擾、提高分析準確性上優于其他2種方法。

總體而言，酶法、Jaffe法肌酐結果與ID-LCMS/MS具有良好的相關性。從相關系數和線性斜率上看，酶法與ID-LC-MS/MS的相關性要優于Jaffe法與ID-LC-MS/MS的相關性。除個別低濃度標本外，酶法與ID-LC-MS/MS具有較好的一致性，而 Jaffe法對 ID-LC-MS/MS的截距為13.14 μmol/L，呈明顯的正偏差，主要集中在低濃度區域(肌酐＜100 μmol/L)。究其原因可能還是存在特異性的問題，血清基質中某些物質干擾Jaffe法肌酐的檢測。雖然ID-LC-MS/MS的線性范圍為4.4 ～885.0 μmol/L，比酶法和 Jaffe 法窄，仍可覆蓋臨床上所有正常人的血清肌酐以及絕大多數病理狀態(如尿毒癥)下的血清肌酐濃度范圍。本研究收集了200例臨床標本，血清肌酐范圍為31 ～365 μmol/L，在 ID-LC-MS/MS 的線性范圍內，因此3種方法的比較基本反映了真實情況。

酶法和Jaffe法測定肌酐均為間接檢測法，易受內源性物質的干擾，而Jaffe法的抗干擾能力更弱[3-4]。ID-LC-MS/MS為直接檢測法，由于經過標本凈化處理和液相色譜分離步驟，可以最大限度地避免與干擾物共流出，減少標本基質效應，再由串聯質譜儀檢測肌酐的母離子和碎片離子，具有極高的檢測特異性和抗干擾能力。采用同位素稀釋法可以最大程度地減少分析過程中的損失和誤差，具有極高的檢測準確性。因此ID-LC-MS/MS常被推薦作為臨床肌酐參考測量方法[7-8，13]。本研究發現高脂和溶血對酶法和Jaffe法肌酐測定有明顯干擾，影響肌酐測定的準確性。與IDLC-MS/MS相比，高脂、溶血對酶法和Jaffe法的肌酐測定產生明顯負偏差。高脂可使Jaffe法的肌酐測定偏差明顯增大。因此在臨床常規檢驗中，采用Jaffe法或者酶法檢測肌酐，若發現標本為高脂或溶血狀態，應當謹慎對待檢測結果。如有條件，建議用ID-LC-MS/MS復核可疑數據。

總之，ID-LC-MS/MS測定血清肌酐在準確性和抗干擾能力方面具有一定的優勢。酶法與同位素稀釋質譜法的血清肌酐測定結果具有較好的可比性，受干擾影響小。Jaffe法的血清肌酐測定結果則存在較大偏差，更加易受干擾影響。

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