肺炎支原體23SrRNA基因突變位點與耐藥表型的分析

葉 蕓， 李蘇亮， 姜 萍， 王 瑤， 楊 超

(西安醫學院附屬醫院，陜西 西安 710077)

肺炎支原體(Mp)是兒童和青少年社區獲得性呼吸道感染的常見病原體之一，其導致的肺炎及肺外并發癥對兒童健康危害嚴重[1-2]。Mp缺乏細胞壁，故對作用于細胞壁的抗菌藥物如青霉素類、頭孢菌素類不敏感，而對影響細菌蛋白質合成的抗菌藥物如大環內酯類、喹諾酮類等敏感[3]。由于兒童處于生長發育期，能夠用于治療兒童Mp感染的藥物選擇更少，首選大環內酯類藥物，主要為14元環的紅霉素和15元環的阿奇霉素。近年來已有多個國家報道了Mp紅霉素耐藥株的出現[4-5]。目前耐藥機制的研究熱點主要為大環內酯類抗菌藥物作用靶位的基因突變。我國也有Mp耐藥株的報道，且耐藥現象嚴重，造成有效抗菌藥物失效。但對于肺炎支原體23SrRNA基因突變位點與耐藥表型之間的關系缺乏系統研究。為了解本地區社區呼吸道感染肺炎支原體感染狀況及進一步明確Mp對大環內酯類抗菌藥物的耐藥機制及基因突變位點與耐藥表型之間的關系，我們從臨床分離培養的Mp中篩選耐藥株，并對23SrRNA藥物作用靶位基因進行檢測，系統分析肺炎支原體23SrRNA基因突變位點與耐藥表型之間的關系。

材料和方法

一、對象

研究對象為2008年6月至2010年6月西安醫學院附屬醫院兒科社區獲得性呼吸道感染患兒400例，男250例，女150例，年齡1～12歲。

二、方法

1.Mp培養基制備 在70 mL支原體(PPLO)基礎培養基中加入新生小牛血清20 mL、50%鮮酵母浸液5 mL、1%酚紅指示劑200μL、20%葡萄糖2.5 mL、2.5%醋酸鉈 1 mL、200000 U/mL 青霉素0.5 mL。新鮮小牛血清由鄭州益康生物有限公司生產;鮮酵母由博而特生物科技有限公司提供;酚紅指示劑購自國藥集團化學試劑有限公司;抗菌藥物購自深圳致君制藥有限公司。

2.標本采集及培養 用滅菌棉簽擦拭感染期患兒咽后壁分泌物，經處理后接種于Mp培養基中，混勻后置37℃溫箱中孵育，并設置陰性與陽性對照。如果有Mp生長，將發酵葡萄糖產酸，使培養基pH值下降，指示劑發生顏色變化，并與陽性對照做對比。顏色由紅變黃可作為有Mp生長的指征。

3.Mp臨床分離株的分子鑒定 Mp聚合酶鏈反應(PCR)熒光探針法定量檢測試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供。

4.體外藥物敏感試驗 按照美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)標準判定每株對大環內酯類抗菌藥物的敏感性，采用微量稀釋法測定臨床分離株的最小抑菌濃度(MIC)[6-7]。用Mp液體培養基倍比稀釋藥物，從256 mg/L稀釋至0.001 mg/L。各管中加入等量菌液(質量濃度為1×108CCU/L)，置于37℃二氧化碳溫箱孵育。8種藥物標準品均購自中國藥品生物制品檢定所，其中14元環大環內酯類抗菌藥物包括紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素，16元環大環內酯類抗菌藥物包括交沙霉素、麥迪霉素、泰利霉素、螺旋霉素，15元環大環內酯類抗菌藥物為阿奇霉素。Mp標準株 M129作為質控菌株，凡是MIC值超出標準株MIC值4倍以上，將其判為耐藥。

5.提取臨床分離株DNA 將冷凍保存的Mp菌株取出后傳代復蘇。當生長時間較穩定后(約7 d)，吸取 20 μL 菌液置于 1.5 mL 離心管中，以13000×g離心10 min，棄去上清液后，然加標本處理液 200 μL并混勻，在 100℃沸水中水浴10 min，此溶液作為DNA模板備用。

6.PCR擴增目的基因片段及 DNA測序 根據GenBank數據庫中的Mp 23S rRNA核酸序列(NC_000912)利用生物學軟件Primer 5.0自行設計巢式PCR擴增所需的引物，見表1。擴增體系為:Mp-1F和Mp-1R引物各15 pmol，TaqDNA聚合酶 1 U，總反應體積 20 μL，其中模板液 5 μL。熱循環參數為93℃預變性2 min、93℃ 1 min、50℃ 1 min、72℃ 1 min，共35個循環，最后1個循環72℃延長5 min，擴增產物為290 bp。然后取2 μL作為模板繼續進行第2輪擴增，用Mp-2F和Mp-2R作為引物，其余條件相同，完成第2次擴增。擴增終產物為244 bp并對其進行電泳，檢測是否存在目的片段。對于經電泳檢測陽性的標本，將過夜培養的菌液直接取1 mL放離心管中送往上海生工生物技術服務有限公司進行測序，測得序列與NCBI已登錄的Mp標準株M129(ATCC 29342D)相應基因序列作比對，每次實驗均設立陽性和陰性對照[7-8]。

表1 巢式PCR擴增引物及產物大小

結 果

一、Mp的分離培養及分子鑒定

400份咽拭子標本共分離培養出Mp 50株，分離陽性率為12.5%。應用PCR熒光探針法定量檢測證實均為Mp。

二、體外藥物敏感試驗檢測結果

按照美國國家臨床實驗室標準化委員會制定的標準，對分離培養陽性的50株Mp及標準株M129進行體外藥物敏感試驗，判定時間為5～14 d，結果發現其中32株(64%)敏感，18株(36%)耐藥。見表2。

表2 32株敏感株的MIC (μg/mL)

三、巢式PCR擴增和DNA測序結果

1.產物電泳 巢式PCR擴增出現的目的條帶見圖1。

2.DNA測序 敏感株與耐藥株的DNA測序結果見圖2～5。

四、突變位點與耐藥株體外藥敏實驗結果

對分離培養陽性的50株Mp及標準株M129進行測序分析，其中32株敏感株與標準株M129比較均未發生基因位點突變。18株耐藥株分別出現A2063G(12/16)、A2064G(3/16)、A2067G(1/16)位點突變，且以A2063G為主(約占75%)，有2株耐藥菌株無基因位點的突變。A2063G突變株表現為對14元環大環內酯類抗菌藥物耐藥，A2064G突變株表現為對14、16元環大環內酯類抗菌藥物耐藥，A2067G突變株表現為對交沙霉素耐藥。見表3。

圖1 巢式PCR產物電泳圖

圖2 Mp敏感株基因測序圖(無點突變)

圖3 Mp耐藥株2063位點突變測序圖

圖4 Mp耐藥株2064位點突變測序圖

圖5 Mp耐藥株2067位點突變測序圖

表3 18株耐藥株體外藥物敏感試驗檢測結果與突變位點結果

討 論

Mp近年來感染呈加重趨勢，所導致的肺炎和肺外并發癥對兒童健康危害嚴重[8-10]。鑒于其自身的結構特點和兒童處于生長發育期的特殊性，大環內酯類抗菌藥物成為治療兒童Mp感染的首選藥物。大環內酯類抗菌藥物通過抑制細菌蛋白質的合成而發揮抑菌作用。作用靶位是細菌核糖體50S大亞基，結合于轉肽酶中心與肽輸出通道狹窄之間的部分，通過機械性的阻塞通道而抑制新生肽鏈的延伸，從而阻礙蛋白質的合成[11]。同時還可抑制核糖體50S大亞基的組裝，導致細胞內有功能的核糖體數量下降，細菌蛋白合成能力下降，結合位點多位于23SrRNAV區中心環的A2063、A2064 位[12]。

Morozumi等[13]分析2002～2006年 Mp菌株對大環內酯類耐藥的情況，發現耐藥株的出現頻率呈增快趨勢。在一定程度上說明Mp對大環內酯類抗菌藥物耐藥非常嚴重。Pereyre等[4]2007年首次報道出現了Mp耐藥株，且認為Mp對大環內酯類耐藥的主要機制是23SrRNA發生點突變。Mp耐藥株的出現造成有效治療抗菌藥物的失效，影響了臨床轉歸。目前認為Mp耐藥機制有以下幾種:(1)靶位改變:基因突變或甲基化;(2)主動外排;(3)藥物滅活[14]。根據以往研究結果[15]，說明某些位點突變與耐藥表型之間有因果關系，但其突變位點與耐藥表型之間的關系需要進一步證實。

本研究從400份社區獲得性呼吸道感染患兒咽拭子標本共分離培養出Mp 50株，分離陽性率為12.5%。分離陽性率較其他地區低[16]，分析原因為采集標本前部分患兒使用過大環內酯類藥物導致Mp已被抑制。因此不能真正反映Mp對大環內酯類抗菌藥物的耐藥率。分離培養陽性的50株中有18株耐藥，耐藥率36%。進一步說明本地區患兒中大環內酯類耐藥肺炎支原體比例非常高，需要引起臨床的高度重視。

本研究分離培養并篩選了18株對大環內酯類耐藥的Mp陽性地方株，并研究了其可能的耐藥機制，結果證實23SrRNA V區靶位基因突變是耐藥性產生的主要機制。18株耐藥株分別出現A2063G(12/16)、A2064G(3/16)、A2067G(1/16)位點突變，且以A2063G為主(約占75%)。有2株耐藥菌株無基因位點的突變，分析其耐藥可能與Mp耐藥的其他機制有關。A2063G突變株表現出對14元環大環內酯耐藥，A2064G突變株表現為對14、16元環大環內酯耐藥，A2067G突變株表現出對交沙霉素耐藥。

本研究對所有Mp感染病例給予阿奇霉素治療，32例對大環內酯類敏感未發生基因突變患者3～7 d發熱消失，1周左右咳嗽減輕，治療2周后復查胸片顯示炎性反應基本吸收。16例對大環內酯類耐藥發生基因突變患者6～10 d發熱消失，2周左右咳嗽減輕，治療3周后復查胸片顯示炎性反應基本吸收。2例對大環內酯類耐藥未發生基因突變患者患者治療后仍有肺紋理增粗，選用左氧氟沙星繼續治療1周后逐漸恢復正常。提示耐藥肺炎支原體感染具有難治性，可導致患兒病程延長，給臨床治療帶來困難。

總之，本研究通過對肺炎支原體23SrRNA基因突變位點與耐藥表型的分析，初步了解了本地區臨床肺炎支原體耐藥現狀及基因突變位點與耐藥表型之間的關系。但由于研究例數不多，尚存在局限性，且體外藥敏試驗對大環內酯類耐藥的臨床意義尚不十分明確，因此有必要通過復制動物模型來進一步研究，為臨床上合理應用抗菌藥物提供參考，從而提高臨床對耐藥 Mp的診治水平。

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