MAGE基因在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義

黎 濤，白崇峰，馬春山，于晉建，王 云

MAGE（melanoma antigen）基因是首先由 Boon等[1]從惡性黑素瘤中分離、鑒定出的一族腫瘤特異性抗原基因，其中MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3基因是最早被發現的三個成員。MAGE-1基因第3外顯子編碼的一段多肽抗原經MHC-Ⅰ類分子HLAA1呈遞后，能夠被自體殺傷性T淋巴細胞（CTL）識別，誘導CTL殺傷腫瘤細胞的活性。本研究采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應 （RT-PCR）和DNA印跡（Southern blot）的方法，對MAGE基因家族的3個成員 MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA 在 56 例非小細胞肺癌（NSCLC）組織中的表達情況進行觀察，探討以該基因家族成員作為靶點對NSCLC患者進行免疫治療的可能性。

1 資料和方法

1．1 細胞系與標本 以人髓性甲狀腺癌細胞系TT作為陽性對照[1]，以小鼠成纖維細胞系3T3TK作為陰性對照。TT細胞和人肺腺癌細胞系SPC-A-1購自上海中科院細胞庫，3T3TK、人肺癌細胞系A549、A431均由上海長征醫院全軍臨床免疫中心細胞免疫室提供，上述細胞系均貼壁生長于含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養基中。56例NSCLC和相鄰正常肺組織標本取自上海長征醫院胸外科手術患者。其中男35例，女21例；年齡33～75歲，平均64.4歲；術后病理證實為鱗狀細胞癌29例，腺癌25例，大細胞癌2例。病變組織被切除后5~10 min進行取材，剪取腫瘤組織和相鄰正常肺組織并立即凍存于液氮中，以保證mRNA不被降解。

1．2 總RNA抽提 培養細胞 （5~10）×106個加入1 ml Trizol裂解液（Gibco BRL公司），覆蓋整個單層細胞；將標本組織剪碎放入勻漿器中，50 mg加入1 ml Trizol，徹底勻漿。將上述培養細胞和標本組織的裂解物移入1.5 ml Eppendorf管中，室溫放置5 min，加入 200 μl氯仿，振蕩混勻，室溫靜置 5 min；1.3×104r/min，4℃離心15 min，將上層水相轉移到干凈的1.5 ml Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置 10 min；1.3×104r/min，4 ℃離心10 min，棄上清，加入 1 ml 75%乙醇溶液，1.3×104r/min，4℃離心10 min，棄上清，將沉淀置于室溫干燥10 min，用DEPC處理水溶解，分光光度計定量。

1．3 逆轉錄合成cDNA第1鏈及PCR反應 按AMV逆轉錄酶（Promega公司）說明書配制逆轉錄反應體系，取 2 μg總 RNA，加入 3 μl AMV 逆轉錄酶，配成終體積為25 μl的反應體系，將該體系置于42℃孵育60 min，94℃ 5 min滅活酶，貯存于-20℃待擴增。MAGE-1基因第3外顯子擴增引物序列[1]：上游 5’-AGT CCT CAG GGA GCC TCC-3’，下游：5’-ACT CAG CTC CTC CCA GAT TT-3’。 內對照β-actin的擴增引物序列為：上游：5-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3，下游：5-AAG AGA GCC TCG GGG CAT CGG AAC CGC TCA-3。PCR反應體系的配制和反應條件見參考文獻[1]。每份標本均以β-actin為內對照，除引物不同外其余條件相同。PCR反應在PE9600型（USA）擴增儀中進行，擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分析，數碼相機拍照。

1.4 PCR擴增產物的轉膜及探針雜交 將細胞系TT、3T3TK、SPC-A-1、A549、A431 和 33 例 MAGE基因表達陽性的瓊脂糖凝膠回收，通過毛細管轉移法將擴增產物轉至尼龍膜上。MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3基因特異性寡核苷酸探針序列分別為[1]：MAGE-1：5’-GGC AAC CCA GTG AGG GTT C-3’；MAGE-2：5’-GAC AAT CCG ATG AGG GCT C-3’；MAGE-3：5’ -GCC AAT CCT ATG AGG ACT C-3’。按地高辛標記試劑盒說明將上述寡核苷酸探針進行標記，在適宜條件下用地高辛標記的寡核苷酸探針與擴增產物進行分子雜交[2]，最后加入適量酶底物液顯色并拍照。

1：電泳 Marker；2：TT；3：SPC-A-1；4：3T3TK；5：A549；6：A431 7、9、11：腫瘤標本①、②、③；8、10、12：正常肺標本①、②、③圖 1 RT-PCR擴增編碼MZ2-E抗原的基因片段

1：TT；2：3T3TK；3：SPC-A-1；4：A549；5：A431；6～38：33 例腫瘤標本圖 2 RT-PCR擴增產物Southern Blot分析結果

圖 3MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA在NSCLC中的表達形式

2.1 MAGE基因在NSCLC組織中的表達 RTPCR目的基因長度為489bp，內對照β-actin長度為422 bp。3種人肺癌細胞系均表達該產物；56例NSCLC患者腫瘤組織中，33例表達該產物，表達率為58.9%，正常肺組織均不表達該產物。檢測樣品的內對照β-actin均有表達（圖1）。

2.2MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA 在NSCLC組織中的表達 3種人肺癌細胞系中，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA的表達情況如下：SPCA-1：MAGE-1+、-2+、-3+，A549：MAGE-1+、-2-、-3+，

2 結果

A431：MAGE-1+、-2+、-3+。56 例 NSCLC 標本中，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA 的表達例數分別是 27、18、30，表達率分別為 48.2%、32.1%、53.6%（圖2）。33例MAGE基因表達陽性的NSCLC標本中，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA 的表達形式為：MAGE-1+、-2+、-3+：12 例；MAGE-1+、-2-、-3+：12 例；MAGE-1-、-2+、-3+：4 例；MAGE-1+、-2+、-3-：2 例；MAGE-1-、-2-、-3+：2 例；MAGE-1+、-2-、-3-：1例；沒有一例標本單獨表達MAGE-2 mRNA。見圖3。

3 討論

MAGE基因家族的編碼蛋白是腫瘤特異性抗原的典型代表。人類MAGE基因家族定位于X染色體上[3]，其家族成員之間的同源性達80%～99%。MAGE基因正常情況下僅在睪丸和胎盤組織中有少量表達，但在多種不同組織來源的惡性腫瘤組織中，該家族基因成員如 MAGE-1、-2、-3、-4、-6 及-12卻常被激活而有不同程度的表達，這可能與腫瘤組織中甲基化調節過程的失控有關[4]。近期的研究表明，NSCLC組織中，由MAGE基因啟動子去甲基化介導的MAGE基因表達與NSCLC的侵襲性密切相關[5]。

本研究采用RT-PCR的技術，用MAGE-1基因第3外顯子的擴增引物進行PCR擴增，MAGE-2和MAGE-3基因在這段序列上與MAGE-1基因具有高度同源性，若有擴增產物出現，則表明這三個基因成員中至少有一種mRNA在檢測對象中有表達，以此了解MAGE基因在NSCLC組織中的表達率。

本文資料顯示MAGE基因家族三個成員在NSCLC中的表達率為58.9%，表明以MAGE基因家族成員作為NSCLC免疫治療的攻擊靶點能夠覆蓋超過半數的患者，并有較好的特異性。3種人肺癌細胞系均表達MAGE基因，這為進一步的實驗奠定了基礎。實驗中所檢測的56例正常肺組織均不表達MAGE基因，說明該基因在NSCLC組織中具有腫瘤組織特異性，有望成為一類新的腫瘤標志物而在NSCLC的早期診斷、微轉移灶檢測和復發的檢測等工作中發揮作用。

本研究還應用Southern blot的方法，對MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3mRNA 在 NSCLC 組織中各自的表達情況進行了研究。結果顯示，MAGE-1、MAGE-3mRNA 在3種人肺癌細胞系中均有表達，MAGE-2 mRNA在2種人肺癌細胞系中有表達，這為進一步的實驗研究包括特異性序列的克隆、轉染等提供了條件。本文資料顯示，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA的表達率分別為48.2%、32.1%、53.6%，與歐洲學者的報道相比，MAGE-1和MAGE-3較高，MAGE-2相近[6]；而日本學者的研究證實，MAGE-1和MAGE-3在NSCLC組織中的表達率分別為32.7%和41.8%[7]，比本文資料顯示的表達率低，說明我國NSCLC患者更適宜以MAGE-1和MAGE-3基因作為免疫治療的攻擊靶點。關于此3種基因的具體表達形式，本文結果表明，3種基因同時表達以及MAGE-1、MAGE-3基因同時表達所占的比例最高，而沒有一例標本單獨表達MAGE-2基因，這一結果與Hiroshi等[8]對食管癌的研究結果相似。由于對MAGE基因的確切功能尚存爭議，因此目前還沒有準確的依據對這一結果作出合理解釋。

MAGE基因的發現有力地推動了人類腫瘤特異性免疫的研究，以該基因家族成員為疫苗對腫瘤進行免疫治療不斷取得新進展[9]。抗原的識別、加工、提呈以及T細胞的致敏、激活和擴增依賴于抗原提呈細胞 （APC）的參與和作用。樹突狀細胞（dendritic cells，DC）是功能最強的 APC，DC 能攝取和加工抗原，表達高水平MHC分子、共刺激分子、粘附分子并分泌高水平Th1型細胞因子IL-12，故有很強的抗原提呈能力，能有效激發T細胞應答，將MAGE基因家族編碼的抗原與DC聯合應用已成為腫瘤免疫治療的新方法[10]。

[1]van der Bruggen P,Traversari C,Chomez P,et al.A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on human melanoma[J].Science,1991,254(5038):1643-1647.

[2]姜 泊.分子生物學常用實驗方法[M].北京：人民軍醫出版社，1996.77-82.

[3]de Backer,Verheyden AM,Martin B,et al.Structure,chromosomal location,and expression pattern of three mouse genes homologous to the human MAGE genes[J].Genomics,1995,28(1):74-83.

[4]Serrano A,Garcia A,Abril E,et al.Methylated CpG points identified within MAGE-1 promoter are involved in gene repression[J].Int J Cancer,1996,68(4):464-470.

[5]Yanagawa N,Tamura G,Oizumi H,et al.MAGE expressions mediated by demethylation of MAGE promoters induce progression of non-small cell lung cancer[J].Anticancer Res,2011,31(1):171-175.

[6]Weynants P,Lethe B,Brasseur F,et al.Expression of MAGE genes by non-small cell lung carcinomas[J].Int J Cancer,1994,56(6):826-829.

[7]Gotoh K,Yatabe Y,Sugiura,et al.Frequency of MAGE-3 gene expression in HLA-A2 positive patients with non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,1998,20(2):117-125.

[8]Hiroshi I,Masaki M,Jian L,et al.Human esophageal carcinomas frequently express the tumor-rejection antigens of MAGE genes[J].Int J Cancer,1995,63(4):523-526.

[9]van Baren N,Bonnet MC,Dreno B,et al.Tumoral and immunologic response after vaccination of melanoma patients with an ALVAC virus encoding MAGE antigens recognized by T cells[J].J Clin Oncol,2005,23(35):9008-9021.

[10]Yu JS,Liu G,Ying H,et al.Vaccination with tumor lysatepulsed dendritic cells elicits antigen-specific,cytotoxic T-cells in patients with malignant glioma[J].Cancer Res,2004,64(14):4973-4979.