胃腸道間質瘤中干細胞因子的表達及與其細胞增殖的關系

侯曉瑋，白辰光，馬大烈，莊興俊

胃腸道間質瘤 （gastrointestinal stromal tumor，GIST）為最常見的胃腸道間葉來源腫瘤，其常見的發病部位為胃、小腸、結直腸等。GIST起源于消化道間質的 Cajal細胞（interstitial cell of Cajal，ICC）或其更原始的祖細胞[1]，腫瘤中存在c-Kit基因（75%～80%）或PDGFRA基因（5%～10%）的功能獲得性突變[2-5]，這些突變導致非配體依賴的受體蛋白的持續活化，激活下游信號傳導通路，阻止細胞發生凋亡，促進細胞增殖，這被認為是GIST的經典發病機制。研究發現，部分GIST具有惡性行為，能夠發生侵襲和轉移。目前認為所有的GIST都有惡性潛能。Flether等提出腫瘤大小和有絲分裂指數可以作為GIST危險度評估的指標[6]，Ki-67指數也可作為GIST預后評估的指標。但是目前促使GIST細胞增殖和轉移的原因卻尚未清楚。干細胞因子（stem cell factor，SCF）為 KIT受體蛋白的配體，由 Steel基因編碼，由于不同的mRNA剪接方式，表達為分子量為31 kD的膜結合型蛋白 （mSCF）和分子量為18.5 kD的可溶性蛋白（sSCF）兩種形式[7]。在正常情況下，SCF與KIT受體結合，誘導KIT蛋白胞外區的構象發生變化，使受體在細胞膜上遷移、聚集，形成二聚體，使胞內酪氨酸殘基磷酸化，調控MAPK和PI3-K等多條信號傳導通路，最終活化胞質內的轉錄因子，調控細胞的生長、增殖和分化。研究發現，由可溶性SCF激活的KIT蛋白通過泛素-蛋白酶體通路迅速被降解，而由膜結合型SCF蛋白激活的KIT能夠保持穩定和持久的活性[8]。目前已證實SCF/KIT通路的活化在ICCs和造血干細胞的增殖分化過程中發揮重要作用[9]，而近期研究發現，在某些腫瘤如宮頸腺鱗癌、惡性黑素瘤、Merkel細胞癌、白血病、轉移性前列腺癌和胰腺癌中，SCF/KIT系統的激活參與了腫瘤的增殖與轉移[10-16]。在GIST中，SCF是否也通過自分泌或旁分泌方式存在，SCF是否能夠發揮活化GIST細胞中KIT蛋白的功能，SCF/KIT信號傳導系統的激活是否在GIST細胞的增殖和轉移過程中發揮作用，值得研究探討。

在本研究中，筆者檢測了68例GIST組織中SCF的表達，分析SCF表達情況與GIST預后評估表 指標的關系，同時結合c-Kit基因的突變狀態分析，探索c-Kit基因的突變與SCF表達有無相關性。

1 資料與方法

1.1 病例資料 收集筆者所在醫院2002～2009年經病理診斷確診的GIST患者共68例。男29例，女39例；年齡23～84歲，平均55歲。腫瘤發生于胃43例（63.2%）、小腸 21例（30.1%）、直腸 2例（2.9%）、未知部位2例（2.9%）。腫瘤直徑0.8～22.0 cm，平均5.8 cm。

1.2 免疫組織化學檢測 在石蠟組織標本的HE染色切片中光鏡下對病變組織進行定位，用蠟塊組織取樣器，每例取直徑4 mm的病變組織，重復3次，制作石蠟組織芯片。使用的抗體分別為兔抗人SCF單克隆抗體 （1∶250）、兔抗人KIT多克隆抗體（1∶150）、兔抗人 Ki-67 單克隆抗體（1∶100）。 免疫組化步驟按Envision法，抗原修復方法均為檸檬酸熱修復。免疫組化結果判定方法為：SCF和KIT陽性為胞膜或胞漿呈明顯棕黃色顯色；Ki-67陽性強度判定是在顯微鏡400倍視野下，計算5個視野的細胞總數，以腫瘤細胞核明顯呈棕黃色者為陽性，陽性細胞數除以腫瘤細胞總數，即為Ki-67抗原標記的細胞增殖指數：設定<5%為-，5%～10%為+，>10%為++。

1.3 組織蛋白抽提與Western-blot檢測 切取黃豆大小新鮮組織，將組織勻漿，加入RIPA裂解液400 μl，冰上裂解 30 min，經 12 000 r/min 低溫離心15 min后吸取上清，BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg/孔，常規SDS-PAGE電泳后將蛋白轉印至PVDF膜，含有0.05%Tween20、5%脫脂奶粉的封閉液封閉PVDF膜2 h，一抗兔抗人SCF單克隆抗體（1∶5000）、兔抗人 KIT 多克隆抗體（1∶1000）、內參蛋白 GAPDH(1∶10 000，上海康成生物)各 3 ml，4℃孵育過夜，洗膜，按1∶10 000加入HRP標記的相應二抗37℃孵育2 h，洗膜后加入ECL系統，暗室顯影2～3 min后沖洗膠片。

1.4 c-Kit基因突變檢測 采用蛋白酶K消化/苯酚-氯仿法抽提組織基因組DNA，以此為模板進行PCR反應擴增c-Kit基因，體系為2 μl模板DNA、25 μl 2×Taq PCR MasterMix（北京天為時代科技有限公司），上下游引物 (10 μmol/l) 各 1 μl，終體積50 μl（引物序列見表 1），反應條件為 94 ℃ 1 min、60℃ 1 min、72℃ 1 min至38個循環。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送上海生工生物公司測序。

1.5 統計學方法 SPSS13.0統計學軟件，采用非參數Mann-Whitney檢驗和McNemar檢驗，P<0.05認為有統計學意義。

A、C：SCF 在 GIST 中的表達；B、D：KIT 在 GIST 中的表達（×400）圖 1 免疫組化檢測SCF和KIT在GIST中的表達

圖2 Western-blot檢測GIST中SCF和KIT的表達

2 結果

2.1 GIST細胞中SCF及相關蛋白的表達 免疫組化檢測68例GIST組織，其中52例組織中SCF表達陽性，表達率為76%，在幾乎所有的陽性標本中，SCF表達均位于腫瘤細胞的胞膜和/或胞漿；KIT蛋白在所檢標本中均表達。部分腫瘤細胞的胞核可見Ki-67 表達（圖 1）。

2.2 Western-blot檢測SCF蛋白 為進一步明確SCF蛋白在GIST中的表達形式，在其中的21例新鮮GIST組織中行蛋白印跡檢測SCF的表達。結果，其中17例標本SCF表達陽性，在分子量為31 kD處可見明顯陽性條帶，其表達與免疫組化檢測結果相一致；同時在所有檢測標本中，分子量為145 kD處均可檢測到KIT蛋白的陽性條帶（圖2）。

2.3 SCF表達與腫瘤增殖相關因素的關系 根據Fletcher提出的GIST危險度分級[6]，所檢測的標本分為極低危2例、低危21例、中危23例及高危22例。在極低危2例中無SCF表達，而SCF在低危、中危和高危標本中的陽性表達率分別為71%、78%和86%（表2）；52例SCF表達陽性標本中，腫瘤平均最大徑為6.1 cm，高于不表達SCF的標本組的平均最大徑4.9 cm。經Mann-Whitney檢驗，SCF陽性標本中的每50個高倍視野病理性核分裂數較SCF陰性標本明顯增多（表3）；表達SCF標本組的Ki-67增殖指數也明顯高于SCF陰性標本（表4）。

2.4 c-Kit基因突變分析及其與SCF表達的關系將68例GIST組織的c-Kit基因行PCR擴增后，成功測序54例，有37例c-Kit基因發生突變，其中外顯子11突變31例，外顯子9突變6例；其余17例組織未發現c-Kit基因突變。結合SCF表達情況，經McNemar檢驗發現，c-Kit基因的突變與否與SCF表達無明顯相關性（表5）。

表 2 SCF在不同危險度分級GIST中的表達

表 3 不同SCF表達的GIST病理性核分裂數

表 4 不同SCF表達的GIST中Ki-67增殖指數

表 5 GIST中SCF表達與c-kit突變的相關性

3 討論

胃腸道間質瘤為最常見的消化道間葉來源腫瘤，KIT蛋白的表達為GIST最重要的病理特征，c-Kit基因發生功能獲得性突變導致KIT蛋白自動磷酸化而激活下游信號傳導，是GIST的重要發病機制，但是GIST細胞繼續增殖和發生遠處轉移的機制尚未完全闡明。GIST中因發生自主磷酸化而活化的KIT蛋白為純和型突變基因所編碼蛋白，然而約20%的GIST無c-Kit突變，且c-Kit突變的GIST中94%的病例為雜和型突變[17]，而幾乎所有GIST中的KIT蛋白均可發生磷酸化[18]，這提示GIST中是否存在另外某種機制促使未突變的c-Kit基因編碼的蛋白發生活化？

KIT蛋白不僅僅在GIST中表達，已有研究發現，在粒細胞白血病、精原細胞瘤、惡性黑素瘤、小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、結腸癌、宮頸癌和卵巢癌中均有KIT蛋白表達[19-25]，在這些腫瘤中，KIT蛋白和其配體SCF的共表達提示KIT/SCF信號通路在腫瘤的增殖過程中發揮作用。最新研究也證實，KIT蛋白的配體SCF通過自/旁分泌促進胰腺癌細胞、惡性黑素瘤細胞、白血病細胞增殖，在前列腺癌骨轉移的組織中也發現KIT和SCF高表達[10-16]。因此，在KIT表達率高達95%的GIST中，SCF是否存在并發揮作用，野生型c-Kit基因所編碼的KIT蛋白是否是被其配體SCF激活，這種激活作用是否是GIST細胞增殖和轉移的機制之一，均有待于研究和解釋。

在本研究中通過免疫組織化學和Western-blot檢測發現，在GIST中存在著SCF的高表達，其表達率為76%，并且KIT和SCF的共表達率也達到74%。此結果證實SCF蛋白在GIST中確切存在。Bono等在GIST患者的血清中檢測到SCF[26]，也支持本文結果。可以推論在GIST中存在SCF的自分泌。同樣也有研究在正常胃腸道組織中檢測到SCF的分泌[27]，結合前述結果可以進一步肯定GIST中存在SCF的自/旁分泌。經過蛋白印跡檢測發現，GIST中所表達的SCF蛋白為分子量31 kD的膜結合型蛋白，此型蛋白對KIT的激活作用能夠達到穩定和持久，可以證明GIST中存在的SCF具備激活KIT活性的生物學功能。

目前研究認為，所有的GIST都具有惡性潛能[6]，腫瘤大小、有絲分裂指數和Ki-67都作為評價腫瘤惡性行為的指標而被廣泛采用。本研究發現，相比較于不表達SCF的GIST，SCF陽性的腫瘤具有更大的體積，有絲分裂指數也明顯增高；在表達SCF及SCF/KIT共表達的GIST中，腫瘤細胞胞核Ki-67染色強度明顯增高，具有統計學差異；同樣，Fletcher危險度分級較高的患者，也具有高的SCF表達率。以上結果均可以初步證實，SCF的表達與GIST的潛在惡變存在一定關系，SCF活化KIT蛋白可能是促進GIST細胞增殖和轉移的主要因素之一。結合c-Kit基因突變狀態分析，筆者發現，SCF表達與否與c-Kit突變并無明顯相關性，提示在GIST中，無論是否存在突變導致的不依賴配體的KIT蛋白自主磷酸化，SCF都有廣泛表達，而SCF的表達就意味著配體依賴的信號通路即SCF/KIT信號傳導通路可能被激活，這也從另一方面證明了SCF在不同突變類型的GIST中促進腫瘤增殖和惡性轉化的可能性。

綜上所述可見，SCF能夠通過自/旁分泌途徑在GIST中發揮刺激細胞增殖的作用；GIST中可能存在KIT蛋白自動磷酸化之外的另外一條重要細胞增殖信號通路，即依賴配體SCF的KIT活化，c-Kit突變可能是腫瘤發生的早期事件，而SCF/KIT通路是促進腫瘤細胞增殖生長的重要因素。但是，SCF在不同突變類型的GIST中發揮作用有何不同，在對野生型KIT蛋白的激活作用之外，對突變型KIT蛋白的活化有何影響，這些問題仍需進一步深入研究和探討，研究GIST中SCF/KIT信號通路的功能作用，有望闡明GIST增殖和轉移機制提供新的思路和證據。

[1]Kindblom LG,Remotti HE,Aldenborg F,et al.Gastrointestinal pacemaker cell tumor(GIPACT):gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal[J].Am J Pathol,1998,152(5):1259-1269.

[2]Heinrich MC,Corless CL,Demetri GD,et al.Kinase mutations and imatinib response in patients with metastatic gastrointestinal stromal tumor[J].J Clin Oncol,2003,21(23):4342-4349.

[3]Hirota S,Isozaki K,Moriyama Y,et al.Gain-of-function mutations of c-Kit in human gastrointestinal stromal tumors[J].Science,1998,279(5350):577-580.

[4]Rubin BP,Singer S,Tsao C,et al.KIT activation is a ubiquitous feature of gastrointestinal stromal tumors[J].Cancer Res,2001,61(22):8118-8121.

[5]Heinrich MC,Corless CL,Duensing A,et al.PDGFRA activating mutations in gastrointestinal stromal tumors[J].Science,2003,299(5607):708-710.

[6]Fletcher CD,Berman JJ,Corless C,et al.Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors:A consensus approach[J].Hum Pathol,2002,33(5):459-465.

[7]Toyota M,Hinoda Y,Itoh F,et al.Expression of two types of Kit ligand mRNAs in human tumor cells[J].Int J Hematol,1992,55(3):301-304.

[8]Miyazawa K,Williams DA,Gotoh A,et al.Membrane-bound stem cell factor induces more persistent tyrosine kinase activation and longer life span of c-Kit gene-encoded protein than its soluble form[J].Blood,1995,85(3):641-649.

[9]Miettinen M,Lasota J.KIT(CD117):a review on expression in normal and neoplastic tissues,and mutations and their clinicopathologic correlation[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2005,13(3):205-220.

[10]Martinho O,Goncalves A,Moreira MA,et al.KIT activation in uterine cervix adenosquamous carcinomas by KIT/SCF autocrine/paracrine stimulation loops[J].Gynecol Oncol,2008,111(2):350-355.

[11]Hofmann UB,Kauczok-Vetter CS,Houben R,et al.Overexpression of the KIT/SCF in uveal melanoma does not translate into clinical efficacy of imatinib mesylate[J].Clin Cancer Res,2009,15(1):324-239.

[12]Ashida A,Takata M,Murata H,et al.Pathological activation of KIT in metastatic tumors of acral and mucosal melanomas[J].Int J Cancer,2009,124(4):862-868.

[13]Krasagakis K,Kruger-Krasagakis S,Eberle J,et al.Co-expression of KIT receptor and its ligand stem cell factor in Merkel cell carcinoma[J].Dermatology,2009,218(1):37-43.

[14]Toki T,Kanezaki R,Adachi S,et al.The key role of stem cell factor/KIT signaling in the proliferation of blast cells from Down syndrome-related leukemia[J].Leukemia,2009,23(1):95-103.

[15]Wiesner C,Nabha SM,Dos Santos EB,et al.C-Kit and its ligand stem cell factor:potential contribution to prostate cancer bone metastasis[J].Neoplasia,2008,10(9):996-1003.

[16]Yasuda A,Sawai H,Takahashi H,et al.The stem cell factor/c-Kit receptor pathway enhances proliferation and invasion of pancreatic cancer cells[J].Mol Cancer,2006,18(5):46.

[17]Emile JF,Theou N,Tabone S,et al.Clinicopathologic,phenotypic,and genotypic characteristics of gastrointestinal mesenchymal tumors[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2004,2(7):597-605.

[18]Antonescu CR,Besmer P,Guo T,et al.Acquired resistance to imatinib in gastrointestinal stromal tumor occurs through secondary gene mutation[J].Clin Cancer Res,2005,11(11):4182-4190.

[19]Cohen PS,Chan JP,Lipkunskaya M,et al.Expression of stem cell factor and c-Kit in human neuroblastoma[J].Blood,1994,84(10):3465-3472.

[20]Hassan S,Kinoshita Y,Kawanami C,et al.Expression of protooncogene c-Kit and its ligand stem cell factor(SCF)in gastric carcinoma cell lines[J].Dig Dis Sci,1998,43(1):8-14.

[21]Hines SJ,Organ C,Kornstein MJ,et al.Coexpression of the c-Kit and stem cell factor genes in breast carcinomas[J].Cell Growth Differ,1995,6(6):769-779.

[22]Inoue M,Kyo S,Fujita M,et al.Coexpression of the c-Kit receptor and the stem cell factor in gynecological tumors[J].Cancer Res,1994,54(11):3049-3053.

[23]Krystal GW,Hines SJ,Organ CP.Autocrine growth of small cell lung cancer mediated by coexpression of c-Kit and stem cell factor[J].Cancer Res,1996,56(2):370-376.

[24]Pietsch T,Kyas U,Steffens U,et al.Effects of human stem cell factor(c-Kit ligand)on proliferation of myeloid leukemia cells:heterogeneity in response and synergy with other hematopoietic growth factors[J].Blood,1992,80(5):1199-1206.

[25]Toyota M,Hinoda Y,Takaoka A,et al.Expression of c-Kit and Kit ligand in human colon carcinoma cells[J].Tumour Biol,1993,14(5):295-302.

[26]Bono P,Krause A,von Mehren M,et al.Serum KIT and KIT ligand levels in patients with gastrointestinal stromal tumors treated with imatinib[J].Blood,2004,103(8):2929-2935.

[27]Théou-Anton N,Tabone S,Brouty-Boyé D,et al.Coexpression of SCF and KIT in gastrointestinal stromal tumours(GISTs)suggests an autocrine/paracrine mechanism[J].Br J Cancer,2006,94(8):1180-1185.