PDGF-D抗體對體外破骨前體細胞分化過程影響的相關研究①

劉栓得 黃 晨 許紅飛 胡 旭 張 超 初同偉 (第三軍醫大學新橋醫院骨科，重慶400037)

惡性腫瘤常常轉移至肝、肺、骨等部位［1］。轉移性骨腫瘤多數表現為溶骨性骨破壞，病人常常經歷多種并發癥，包括病理性骨折、椎體壓縮與破壞、頑固性骨痛等，這嚴重地影響了患者的生活質量和生存期［2］。“種子-土壤”學說提示［3］:轉移至骨的腫瘤細胞破壞了成骨細胞(Osteoblasts，OBs)與破骨細胞(Osteoclast，OCs)間的生理平衡，使得宿主自身正常OCs過度分化、成熟，進而過度溶骨，造成嚴重的骨破壞，在此過程中眾多腫瘤相關細胞因子發揮了重要作用［4］。

PDGF-D是PDGF家族中的新成員，它是通過進行EST數據庫比對尋找新的血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)同源體的過程中發現的［5］。PDGF-D一般通過旁分泌的方式作用于細胞表面其特異性受體PDGF受體β(PDGFR-β)，近而發揮促細胞分裂、分化、調節細胞周期等作用［6］。在前期實驗中，我們引入外源性PDGFD，在沒有NF-κB配體激活因子(Receptor or Activator of NF-κB Ligand，RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor，M-CSF)聯合誘導的條件下成功誘導PBMCs成為OLCs(結果不在此詳述)，但PDGF-D抗體是否可以阻斷此活化過程尚不知曉，因此本實驗引入外源性人重組PDGF-D Ab體外刺激PBMCs，觀察其對OCs分化過程的影響。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑 采集16例健康志愿者外周血，白細胞計數均為正常范圍內。重組人PDGF-D、重組人 PDGF-D Ab(R＆D systems)、α-MEM 培養基和D-Hanks液(HyClone)、優質胎牛血清(Gibco)、人外周血淋巴細胞分離液及TRIczol(TBD)、TRAP染色試劑盒(Sigma)、骨磨片(自制)、人MMP-9酶聯免疫吸附試驗試劑盒(上海迪奧生物制品)、Prime-Script?逆轉錄試劑盒及熒光染料SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)、兔抗人Cathepsin K單克隆抗體(Bioss)、羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗、彩色預染蛋白質分子量標準、青鏈霉素雙抗、SDS蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天)。

1．2 方法

1．2．1 外周血單個核細胞的分離純化采集健康成人新鮮外周血40 ml［1］，按照人外周血淋巴細胞分離液(TBD)說明書操作，分離出的外周血單個核細胞于α-MEM培養基(含10%FBS，1%青鏈霉素雙抗)吹打均勻，細胞計數后按照密度1×106個/ml單核細胞接種于100 ml細胞培養瓶中，于37℃，5%CO2環境的細胞培養箱中孵育48小時。棄上清，DHanks液反復漂洗，1．5 ml 0．25% 胰蛋白酶消化貼壁細胞，收集細胞后1 000 r/min，離心8分鐘，α-MEM培養基重懸細胞，將獲得的PBMCs細胞密度調整為 1 ×107ml－1。

1．2．2 實驗分組 本實驗分為誘導組IG(α-MEM培養基+10%FBS+1%青鏈霉素雙抗+50 ng/ml PDGF-D)、阻斷組BG(α-MEM培養基+10%FBS+1%青鏈霉素雙抗+50 ng/ml PDGF-D+30 ng/ml PDGF-D Ab)及對照組CG(α-MEM培養基+10%FBS+1%青鏈霉素雙抗)，將各組100 μl細胞懸液均勻接種于96孔培養板中，每組3個復孔，置于37℃，5%CO2的細胞培養箱中孵育，每3天換液，連續培養15天。

1．2．3 細胞形態的觀察及細胞骨吸收功能鑒定倒置相差顯微鏡觀察各組細胞的形態。于誘導的第15天對各組細胞進行TRAP染色觀察，嚴格按照TRAP染色試劑盒說明進行，PBS液漂洗后蘇木精復染細胞核。于倒置相差顯微鏡下觀察每孔隨機6個視野中TRAP染色陽性OLCs(胞核≥3個)并攝片。骨磨片吸收陷窩分析:取出預置的骨磨片(自備的牛股骨片)經2．5%戊二醛液固定15分鐘，去離子水超聲清洗3次，每次10分鐘，梯度乙醇脫水，自然晾干，1%甲苯胺藍染液室溫染色20秒，PBS反復沖洗晾干，倒置相差顯微鏡下觀察骨吸收陷凹形態。

1．2．4 Real-time PCR 檢測 TRAP、Cathepsin K、MMP-9 mRNA的表達 于第15天收集各組細胞(1．0 ×106個)，加入 1 ml TRIczol并依照使用說明提取各組細胞總RNA，取待測樣本各2 μl RNA于微量核酸儀測定濃度，選取OD(260)/OD(280)為1．8 ～2．0 的 RNA 樣本，依照 PrimeScript?逆轉錄試劑盒操作說明進行。使用Primer Premier 6．6軟件設計相關引物并由上海生工生物技術有限公司合成。GAPDH引物序列:正義鏈 5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，反 義 鏈 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'，片段長度258 bp;Cathepsin K引物序列:正義鏈 5'-AAGAGGTGGTTCAGAAGATG-3'，反義鏈5'-TATTGGAAGGCATTGGTCAT-3'，片段長度113 bp;TRAP引物序列:正義鏈 5'-GCAAGGTCCCCAACGGCTATC-3'，反義鏈 5'-GCCTCGGCAGCCTGGTCT-3'，片段長度112 bp;MMP-9引物序列:正義鏈5'-CGACCAAGGATACAGTTTGTT-3'，反義鏈5'-GCGGTACATAGGGTACATGAGC-3'，片段長度107 bp。PCR反應體系為20 μl，反應液各組成分別為:SYBR Premix Ex TaqII 10 μl，上游引物 0．8 μl，下游引物 0．8 μl，DNA 模板 2．0 μl，dH2O 6．0 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0．4 μl。每組 3 個復孔。PCR反應條件為，95℃，30秒，1個循環;95℃，5秒，58℃，34秒，40個循環。反應體系于ABI 7500 Realtime PCR儀上進行檢測，自動掃描并記錄熒光強度。通過調整模板濃度使內參GAPDH擴增Ct值介于18～30之間。應用ABI 7500 System SDS Soft-ware1．3．1軟件進行數據處理，其相對表達量采用2－ΔΔCt方法計算。獨立重復實驗3次。

1．2．5 ELISA法檢測MMP-9在各組細胞上清中的表達 收集各組第15天細胞上清液，于3 000 r/min，離心10分鐘以去除顆粒和聚合物，設置標準品和細胞上清液樣本孔，調整體系為50 μl，所有檢測均采用復孔檢測，具體操作嚴格按照MMP-9 ELISA試劑盒(上海迪奧)說明進行，最終反應板于TECAN F039300酶標儀(奧地利)上測定蛋白的濃度(μg/ml)［8］。根據標準品 MMP-9的抗原濃度值設為X軸，其對應的OD(450 nm)吸光值設為Y軸，建立標準曲線的直線回歸方程［(Y=0．89X+0．133，R2=0．999 9)］，各樣品的濃度可由標準曲線獲得。獨立重復實驗3次。

1．2．6 Western blot檢測各組細胞 Cathepsin K 蛋白的表達 SDS裂解液分別裂解第15天各組細胞并提取細胞內總蛋白，BCA蛋白濃度測定法進行蛋白定量，SDS-PAGE電泳分離后濕轉法電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2小時，兔抗人Cathepsin K多克隆抗體(1∶100)4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次10分鐘，羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶500)，37℃孵育1小時，TBST漂洗3次，每次10分鐘，ECL法顯色、曝光8分鐘并攝影。用Image J分析軟件分析圖片各條帶灰度值。

2 結果

2．1 TRAP染色和骨吸收實驗觀察破骨樣細胞倒置顯微鏡下觀察，培養第15天各組細胞經TRAP染色顯微鏡下觀察(圖1)，誘導組可見多個多核破骨樣細胞細胞，胞漿呈現紫紅色顆粒沉淀反應，顏色均勻，胞核藍染，胞內可見多核(胞核≥3個)，可見深色核仁，細胞呈典型的“荷包煎蛋”樣形態;而阻斷組和對照組細胞較小，多為單核，部分細胞胞漿皺縮，核固縮，呈現凋亡狀態，未見多核破骨樣細胞。骨片經甲苯胺藍染色后觀察(圖2)，誘導組細胞骨片上可觀察到骨面蟲蝕狀骨吸收陷凹，陷凹面積較大且呈現破骨樣細胞樣形態，陷窩邊緣呈不規則放射狀，顏色相對背景較深;而阻斷組和對照組骨片上未見骨吸收陷凹形成。結果提示:誘導組可培養可得到成熟破骨樣細胞并具有骨吸收能力，而在同樣條件下引入PDGF-D Ab后，阻斷組OLCs分化受到明顯抑制。

圖1 第15天，誘導組可見TRAP陽性OLCs，而阻斷組和對照組未見(×200)Fig．1 The OLCs were detected and showed in TRAP staining test in IG，but there was no one detected in CG and BG(×200)

圖2 第15天，誘導組可見骨吸收陷窩，而阻斷組和對照組未見(×200)Fig．2 The OLCs were detected and showed in bone resorption test in IG，but there was no one detected in CG and BG(×200)

圖3 三組細胞中TRAP、MMP-9、Cathepsin K mRNA的相對表達Fig．3 At the 15 d，therelative mRNA expression levels of TRAP，MMP-9 and Cathepsin K in 3 groups were detected by Real-time PCR

圖4 第15天，各組細胞上清液中MMP-9的相對表達Fig．4 At the 15 d，the expressions of MMP-9 protein in 3 groups were detected by ELISA

2．2 Real-time PCR 檢測 TRAP、Cathepsin K、MMP-9 mRNA的表達 三組細胞培養15天后，Real-time熒光定量PCR檢測TRAP、Cathepsin K、MMP-9 mRNA的表達:第15天阻斷組和對照組TRAP、Cathepsin K、MMP-9 mRNA的表達均顯著低于誘導組(P＜0.05)，其中以TRAP mRNA相對表達的差異最為顯著;阻斷組和對照組的表達無明顯差別(P＞0．05)。

2．3 ELISA法檢測MMP-9在各組細胞上清中的表達 檢測第15天各組細胞上清中MMP-9蛋白的表達情況:誘導組［(289．96 ±7．35)μg/L］，顯著高于阻斷 組 ［(187．28 ± 5．64)μg/L］和 對 照 組［(194．34 ±6．53)μg/L］，P 值均 ＜0．05，而阻斷組與對照組間差異無統計學意義(P＞0．05)。結果顯示PDGF-D Ab可抑制PNMCs向OLCs分化過程中MMP-9的表達(圖4)。

圖5 第15天各組細胞Cathepsin K蛋白的表達及灰度分析Fig．5 At the 15 d，the expressions of the Cathepsin K protein were detected in 3 groups by Western blot and there was a relative density of them

2．4 Western blot檢測各組細胞Cathepsin K蛋白的表達 提取各組第15天細胞的總蛋白，Western blot檢測各組細胞中Cathepsin K蛋白的表達，內參為GAPDH，曝光顯像后射片，Image J分析軟件分析圖片各條帶灰度值:阻斷組和對照組Cathepsin K蛋白的表達量無顯著差異(P＞0．05)，而兩組均顯著低于誘導組Cathepsin K的表達(P值均＜0．05，圖5)。

3 討論

腫瘤骨轉移造成的骨破壞是一個十分復雜的過程，其中包括腫瘤細胞的脫落、遷移、侵襲、粘附和定植等多個過程［9］。而OCs作為體內專職骨吸收細胞，其過度活化成為造成骨破壞的關鍵事件。RANKL和M-CSF聯合誘導外周血單個核細胞向OLCs分化的方法是較為經典的獲得OLCs方法，但Huang等［10］通過用 PDGF-D體外刺激鼠單核細胞系RAW264．7，成功將其誘導分化為 OLCs，而后于該實驗組內加入OPG，經誘導后同樣分化為OLCs，因此認為該途徑獨立于RANKL/RANK/OPG信號通路之外。本課題組于前期實驗中證明，PDGF-D可獨立誘導PBMCs分化為OLCs，并且其形態、功能以及OCs的標志性基因和蛋白的表達與經典誘導方法獲得的OLCs無差異。

PDGF-D由370個氨基酸組成，分子量約為40.2 kD，也是PDGF家族新成員之一，起著促進細胞增殖、侵襲和促血管生成等作用［11］。以酶原形式分泌的PDGF-D蛋白無活性，在纖溶蛋白酶等多種蛋白酶的水解作用下，將其鉸鏈區N末端CUB結構和C末端生長因子結構分離開來，形成同源二聚體PDGF-DD后作用于其特異性受體 PDGFR-β，從而發揮其生物學功能［12］。Wang 等［13］通過 siRNA 使得胰腺癌PDGF-D的表達下調，從而使Notch-1和NF-κB信號通路失活進而抑制了細胞生長和血管生成，降低了腫瘤細胞的侵襲能力。同時，Kong等［14］證實PDGF-D過表達可提高前列腺癌細胞上皮-間質轉化(epithelial-mesenchynal transition，EMT)的能力，從而提高其侵襲轉移的能力。

本實驗旨在觀察PDGF-D抗體對外源性PDGFD的阻斷作用，檢測其對破骨細胞前體細胞向OLCs分化過程的影響。通過研究發現:誘導組細胞在經過15天的誘導后成為TRAP陽性細胞，并具有骨吸收功能，而阻斷組和對照組未見OLCs細胞;同時，OLCs特異性標記物TRAP、Cathepsin K和MMP-9的表達，誘導組均顯著高于阻斷組和對照組。因此我們認為，PDGF-D抗體可有效阻斷PDGF-D誘導單核細胞向OLCs分化的過程，抑制OLCs的生成。

有文獻表明，PDGF-D可通過與PDGFR-β作用影響多條下游通路，如 PI3K/Akt、MAPK、Noth等［15-17］，而這些通路與 OCs、OBs的分化、成熟密切相關，但究竟何者為關鍵尚不知曉。Najy等［18］稱過表達PDGF-D的前列腺癌細胞可促進溶骨性反應，那么是否可以通過使腫瘤細胞不表達PDGF-D蛋白，從而抑制破骨細胞的過度分化，或者通過阻斷如PI3K/Akt、MAPK、Noth等下游某條或多條通路是否可以抑制溶骨性破壞過程等等，這些均成為我們今后思考和研究的重要方向。

綜上所述，我們證實PDGF-D抗體可有效阻斷PDGF-D破骨前體細胞向OLCs分化過程，但其在體內作用如何以及PDGF-D對下游通路的影響機制等等需要我們進一步的研究。

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