肝特異性的miR-122對肝癌細胞增殖及凋亡的影響①

莊 鵬 李志瑩 王湘郴 鄭昌京 (深圳第四人民醫(yī)院感染科，深圳518033)

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害居民生命健康。由于肝癌早期診斷困難，治療手段有限，總體預(yù)后較差，因此，如何尋找便捷有效的肝癌早期診治的靶標(biāo)仍是一個迫切需要解決的問題。

microRNA作為一類新的分子靶標(biāo)，是基因表達的主要調(diào)控因子之一［1］，參與多種生命活動包括細胞增殖、凋亡、分化、遷移、腫瘤形成等。研究發(fā)現(xiàn)microRNA表達失調(diào)可能會引發(fā)癌癥及其他疾病的發(fā)生［2-4］。miR-122是一個肝特異性的 microRNA，有報道證實它能引起肝癌細胞的周期抑制，但是對于具體的調(diào)控功能機制目前尚不清楚［3］。本研究擬通過以人工合成的miR-122的類似物轉(zhuǎn)染到HepG2肝癌細胞，來觀察其對于肝癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1．1 材料 HepG2及Hep3B細胞為香港中文大學(xué)CEID饋贈;胎牛血清 FBS、Trypsin-EDTA、TRIZOL、LipofectaminTM2000購自Invitrogen公司;MTT購自Sigma公司;NCodeTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit購自Invitrogen公司;Q-PCR檢測的SYBR Green PCR master mix購自Roche公司。

miR-122及其反義序列購自上海吉瑪公司，序列如下:miR-122:5'UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG3';anti-miR-122:5'CAAACACCAUUGUCACACUCCA3';NC sequence:5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3';anti-NC sequence:5'CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3'。

1．2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HepG2細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并含有100 μg/ml鏈霉素，100 μg/ml青霉素的雙抗，培養(yǎng)條件為 5%CO2、37℃。轉(zhuǎn)染前1天將細胞接入培養(yǎng)板，24小時內(nèi)待細胞生長密度達到60%～80%左右即可轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體LipofectamineTM2000，參照其說明書轉(zhuǎn)染miR-122的類似物、miR-122的反義序列以及隨機對照序列(NC)。

1．3 Q-RT-PCR檢測成熟的miR-122的表達量轉(zhuǎn)染前1天，將HepG2細胞以0．5×105接入12孔板，24小時內(nèi)向細胞轉(zhuǎn)染miR-122類似物，轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞，提取細胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄采用Invitrogen的NCodeTMmiRNA First-Strand complementary DNA Synthesis試劑盒得到模板cDNA，然后采用ABI公司的Fast SYBR?Green Master Mix進行Real time PCR操作，所用儀器ABI 7500 Real Time PCR儀。miR-122引物一條為成熟的miR-122，5'TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG3';另一條為 NCodeTM試劑盒所帶的通用引物。U6作為內(nèi)參，引物序列為:上游引物:5'TTCACGAATTTGCGTGTCAT3';下游引物:5'CGCTCGGCAGCACATATAC3'。具體程序是:50℃，2分鐘;95℃，10分鐘;95℃，15秒，60℃，1分鐘，40循環(huán)。

1．4 MTT法檢測miR-122對細胞增殖的影響 制備HepG2和Hep3B的單細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞數(shù)為5 ×104ml－1，加入到 96 孔板，每孔 100 μl，每種細胞分為4個實驗組，轉(zhuǎn)染miR-122類似物和anti-miR-122為實驗組，另設(shè)空白對照組和轉(zhuǎn)染隨機序列(NC)為陰性對照組。每組設(shè)置6個重復(fù)孔。于37、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)72小時后，加入新鮮配制的5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。然后，棄去上清，每孔加入150 μl DMSO，震蕩15分鐘，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm下各孔的吸光值。結(jié)果以實驗組平均值與空白對照組的平均值的百分比表示。

1．5 凋亡細胞的DAPI染色 轉(zhuǎn)染miR-122類似物及anti-miR-122的細胞于72小時收樣，70%乙醇固定24小時，然后細胞懸液中加入終濃度為10 μg/ml的DAPI，室溫避光孵育5分鐘，然后熒光顯微鏡下觀察。

1．6 Annexin和PI熒光雙染檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞，分別以NC、miR-122及anti-miR-122處理細胞，并設(shè)置未處理的細胞做空白對照。48小時后收集細胞，PBS洗滌3次，然后加入到預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液 500 μl中，加入 5 μl Annexin V-FITC 和 2．5 μl PI于細胞懸液中，輕輕混勻，F(xiàn)CM檢測凋亡細胞。

1．7 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS13．0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，所有實驗均重復(fù)3次以上，實驗各組間均數(shù)比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2．1 miR-122轉(zhuǎn)染及其表達 為了檢測miR-122轉(zhuǎn)染到肝癌細胞系中是否提高其表達，我們將miR-122 mimics及anti-miR-122分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞，培養(yǎng)至48小時，收集細胞提取RNA做Q-PCR檢測。圖1結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-122后，與細胞空白對照組相比，HepG2細胞中成熟miR-122的表達量有非常明顯的升高，同時anti-miR-122轉(zhuǎn)染組沒有明顯變化。作為miR-122的反義序列anti-miR-122，只能阻斷了miR-122的功能，并不影響其本身的表達，故Real time PCR檢測不到miR-122表達的變化。

2．2 miR-122抑制HCC細胞的增殖 為了檢測miR-122對 HepG2細胞增殖的影響，用 miR-122 mimics及anti-miR-122轉(zhuǎn)染細胞，對照為隨機序列，轉(zhuǎn)染72小時后，測定細胞增殖的變化。由圖2可知，與隨機對照相比，轉(zhuǎn)染miR-122組的細胞增殖被明顯抑制，并且anti-miR-122轉(zhuǎn)染組細胞增殖反而上升了，這說明miR-122參與對肝癌細胞的生長增殖的調(diào)控。

2．3 miR-122促進 HepG2細胞的凋亡 miR-122和anti-miR-122轉(zhuǎn)染HepG2細胞72小時后，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)miR-122組很多細胞核內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體，而NC組和anti-miR-122組細胞幾乎沒有發(fā)現(xiàn)，見圖3。為了進一步定量確定凋亡細胞，我們將miR-122轉(zhuǎn)染48小時后，收集細胞，通過Annexin V和PI雙染色后，采用流式細胞技術(shù)檢測凋亡細胞數(shù)。如圖4所示，miR-122轉(zhuǎn)染組有26．6%的細胞為凋亡細胞;而NC對照組和anti-miR-122組各自僅有10．6%和9．2%細胞為凋亡細胞。

圖1 miR-122轉(zhuǎn)染后HepG2細胞內(nèi)miR-122的表達水平Fig．1 The expression levels of miR-122 in HepG2 cells after transfected with miR-122 mimics

圖2 MTT結(jié)果顯示miR-122對肝癌細胞生長的抑制作用Fig．2 The inhibition of miR-122 on HepG2 cells was determined by MTT assay

圖3 DAPI染色分析miR-122轉(zhuǎn)染后引起的HepG2細胞的凋亡Fig．3 The apoptotic bodies induced by miR-122 in HepG2 cells were visualized by fluorescence microscope after staining with DAPI

圖4 流式細胞技術(shù)分析miR-122誘導(dǎo)的細胞凋亡Fig．4 The quantitative analysis of apoptotic cells induced by miR-122 was determined by FACS

3 討論

miR-122是肝臟特異的miRNA，它不僅參與肝臟分化的調(diào)節(jié)，還在維持肝臟正常功能中起著重要作用，當(dāng)前關(guān)于miR-122與肝癌關(guān)系的研究正逐漸成為熱點。

據(jù)報道在70%的肝癌組織中miR-122表達下降［5］，cyclin G1表達上調(diào)，使得更多的癌細胞處于S期，這些效應(yīng)可能與抑制其表達使更多的細胞阻滯于G1期及間接調(diào)節(jié) P53依賴性細胞分裂路徑相關(guān)。多項研究還發(fā)現(xiàn)miR-122表達下調(diào)與肝癌病人的預(yù)后及腫瘤遷移有關(guān)，可能與miR-122表達下調(diào)后引起下游靶基因的異常表達有關(guān)［6，7］。同時在肝癌來源的細胞株如HepG2和Hep3B中也觀察到miR-122有低表達［8］。上述研究表明miR-122的表達下調(diào)可促進肝癌細胞惡性表型的轉(zhuǎn)變，因此miR-122有望成為一個肝癌診斷及治療的新靶標(biāo)［9］。

既往的研究表明miR-122可能是在肝癌發(fā)生過程中的一個調(diào)節(jié)因子，也可能是肝癌的一個潛在的生物標(biāo)志［10］。本研究以HepG2細胞為肝癌的細胞模型，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-122組的HepG2細胞增殖被明顯抑制，并可引起轉(zhuǎn)染后細胞凋亡。這表明miR-122參與對肝癌細胞生長增殖的調(diào)控，提示miR-122在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用，扮演著腫瘤抑制物的角色，但其具體機制仍有待于進一步闡明。

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