結核桿菌熱休克蛋白70劑量相關的免疫調節(jié)作用

高志玲 孫麗媛 戴 琎 (吉林省白城醫(yī)學高等?？茖W校，白城137000)

結核桿菌熱休克蛋白70(HSP70)能刺激固有免疫和獲得性免疫系統(tǒng)，交叉提呈抗原給MHCⅠ類分子產生特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，被廣泛地應用于抗腫瘤、抗病毒疫苗的佐劑［1，2］。近年來，在類風濕性關節(jié)炎、Ⅱ型糖尿病等自身免疫性疾病模型中發(fā)現，HSP70可以產生抑制性細胞因子IL-10，并促進Treg的產生，從而保護自身免疫性疾病的發(fā)展［3，4］。上述結果表明HSP70具有刺激和抑制機體免疫系統(tǒng)的雙重活性，但具體機制尚不明確。免疫抗原過大過小都可以引起抗原的免疫耐受［5］，由此推斷HSP70這種雙重的免疫學功能可能與劑量相關。為了驗證這一假設，我們將不同劑量的HSP70在體外刺激小鼠樹突狀細胞(DC)，檢測了DC表面分子CD86的表達情況以及IL-10的表達水平，此外我們將不同劑量的HSP70免疫NOD小鼠，觀察HSP70對NOD小鼠糖尿病發(fā)生率以及Treg的產生的影響。旨在揭示HSP70雙重免疫學功能的機制并為其應用提供理論指導。

1 材料與方法

1．1 材料 結核桿菌熱休克蛋白70購自樂博生物有限公司;IL-10試劑盒購于上海百沃科技有限公司;IL-4、GM-CSF購于 PeproTech公司，IMDM培養(yǎng)基干粉、新生牛血清、胰蛋白酶均購于Gibco，Ficoll液購于湖南晶科生物科技有限公司;其它常用試劑購買于國產試劑公司。實驗所需的C57BL/6小鼠購于長春生物制品所;6周齡的雌性非肥胖糖尿病小鼠(non-obese diabetes mice，NOD mice)購于北京維通利華;抗CD4-PEcy5抗體、抗Foxp3-PE抗體購買于eBioscience。

1．2 方法

1．2．1 樹突狀細胞的制備 取3只C57BL/6小鼠眼球取血，用Ficoll液從外周血分離外周血單個核細胞(PBMC)，分鋪在12孔培養(yǎng)板內，每孔加入1 ml細胞懸液，培養(yǎng)2小時后，用PBS洗板3次，去除未貼壁的淋巴細胞，每孔加入500 U/ml IL-4、500 U/ml GM-CSF和10%的IMDM培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第三天補加細胞因子，第五天時，收集未貼壁和貼壁不牢的細胞即為未成熟的樹突狀細胞用于后續(xù)實驗。

1．2．2 HSP70刺激DC表達CD86分子 將培養(yǎng)到第5天的未成熟的樹突狀細胞與不同濃度的HSP70(0、2、10、50、100、200 μg/ml)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日，收集培養(yǎng)上清用于細胞因子檢測，收集的細胞用FITC標記的抗CD86單克隆抗體染色40分鐘，進行流式細胞術檢測。

1．2．3 HSP70對IL-10表達量的影響 將收集的DC培養(yǎng)上清，按照IL-10 ELISA試劑盒說明書操作，檢測上清中IL-10的含量。

1．2．4 HSP70對NOD小鼠糖尿病模型發(fā)病率的影響 將30只6周齡的NOD小鼠隨機分成3組，對照組皮下免疫PBS，其余兩組小鼠分別免疫不同劑量的 HSP70(10 μg/只、100 μg/只)，一周一次，免疫3次，每周用葡萄糖試紙檢測小鼠尿液中葡萄糖的含量，當小鼠尿中的葡萄糖水平達到1 000 mg/dl以上時，認定是糖尿病模型成立。

1．2．5 HSP70對 NOD小鼠脾細胞中 Treg比例的影響 各組分別處死3只NOD小鼠，取脾臟制備脾細胞，制成脾細胞懸液。調整細胞濃度為1×106個/ml，加入 1．5 μl抗 CD4-PEcy5 抗體，避光孵育15分鐘后，加入固定/破膜工作液對細胞固定和破膜，再加入抗 Foxp3-PE 抗體各1．5 μl，染色30分鐘后清洗，流式細胞儀分析Treg細胞百分率。

1．3 統(tǒng)計學分析 實驗數據用SPSS16．0軟件分析，用Kaplan-Meier分析NOD小鼠糖尿病的發(fā)生率，用單因素方差方法(one-way ANOVA)分析余下所有實驗數據，P＜0．05代表有統(tǒng)計學意義，P＜0.01是有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 不同劑量HSP70對DC成熟的影響 流式分析結果顯示在 0～50 μg/ml濃度范圍內，隨著HSP70濃度增高，表達CD86的DC陽性百分率逐漸升高，在50 μg/ml時CD86表達量最高，與其在2 μg/ml時有統(tǒng)計學意義(P=0．037)，當濃度達到100、200 μg/ml時，DC表達 CD86的陽性率反而降低，均低于50 μg/ml時的陽性率(P ＜0．05)，因此說明在小劑量范圍內HSP70可以刺激DC的成熟，大劑量的HSP70反而可以抑制DC的成熟，見圖1。

2．2 HSP70刺激DC產生IL-10具有劑量依賴性實驗結果表明，HSP70在體外可刺激DC產生IL-10，隨著劑量的增加，IL-10的產生也逐漸增多(P＜0．05)，見圖2。

圖1 不同劑量HSP70對DC表達CD86的影響Fig．1 Effect of HSP70 at different dosage on the expression of CD86 on DC

圖2 不同劑量的HSP70對IL-10表達量的影響Fig．2 Effect of HSP70 at different dosage on the expression of IL-10

2．3 大劑量 HSP70降低 NOD小鼠糖尿病的發(fā)病率 實驗結果表明，大劑量的HSP70可以顯著降低NOD小鼠糖尿病的發(fā)生率，與對照組比有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0．01)，而小劑量 HSP70不能降低NOD小鼠糖尿病的發(fā)生率，見圖3。

圖3 HSP70對NOD小鼠糖尿病發(fā)病率影響Fig．3 Effect of HSP70 on diabetes incidence of NOD mice

圖4 HSP70對NOD小鼠Treg影響Fig．4 Effect of HSP70 on Treg of NOD mice

2．4 大劑量HSP70增加NOD小鼠的Treg 實驗結果表明，大劑量的HSP70可以顯著增加NOD小鼠糖尿病的Treg，與對照組比有顯著統(tǒng)計學意義(P ＜0．01)，見圖4。

3 討論

結核桿菌熱休克蛋白70(HSP70)能夠刺激機體免疫系統(tǒng)，被廣泛應用于疫苗的佐劑［1，2］。然而在自身免疫性疾病模型中，HSP70也可能引起免疫耐受，但是具體的機制不明［3，4］。本實驗研究表明HSP70在小劑量時可以刺激DC的成熟，大劑量時可以抑制DC的成熟。進一步研究表明HSP70可以在體外刺激DC產生大量的抑制性細胞因子IL-10，并呈劑量依賴性，這或許能夠解釋大劑量的HSP70能夠引起免疫抑制的原因。

有研究表明HSP60也能在自身免疫性疾病模型中發(fā)揮免疫抑制活性，并伴有Treg和IL-10水平升高［6］。小劑量的HSP70之所以能夠刺激免疫系統(tǒng)可能是由于HSP70刺激產生其他的刺激性因子，其刺激活性作用強于其誘導產生的IL-10的抑制活性，所以在小劑量時主要表現為激活機體的免疫系統(tǒng)。隨著劑量的增大，IL-10等抑制因子逐漸增多，其抑制活性可能大于其激活的刺激性因子的活性，表現為HSP70的免疫抑制活性。熱休克蛋白96(gp96)在用于腫瘤疫苗佐劑時小劑量的抗腫瘤效果要優(yōu)于其大劑量的抗腫瘤效果，其機制是gp96同時刺激特異性的CTL和Treg的產生，小劑量gp96激發(fā)的CTL的活性要強于Treg的抑制活性，而大劑量的gp96激發(fā)Treg的比例顯著升高，其發(fā)揮的抑制活性要強于其激發(fā)的CTL，所以限制了其作為腫瘤疫苗佐劑的活性［7］。NOD小鼠可以自發(fā)進展為自身免疫性糖尿病，而研究表明Treg細胞能夠抑制自身免疫性的發(fā)展，Treg比例升高可以顯著抑制NOD小鼠糖尿病的發(fā)生率［8］。體外實驗表明，大劑量的HSP70可以產生大量抑制性因子IL-10。體內實驗表明，大劑量的HSP70可以顯著誘導Treg的產生，抑制NOD小鼠的糖尿病發(fā)病率。本實驗的結果表明HSP70的免疫激活和抑制活性與其劑量相關，用作疫苗佐劑時應用小劑量，用于治療自身免疫性疾病時應加大使用的劑量，為HSP70的應用提供了一定的理論依據。

1 Massa C，Melani C，Colombo M P．Chaperon and adjuvant activity of hsp70:different natural killer requirement for cross-priming of chaperoned and bystander antigens［J］．Cancer Res，2005;65(17):7942-7949．

2 Li G，Zhang J，Tong X et al．Heat shock protein 70 inhibits the activity of influenza a virus ribonucleoprotein and blocks the replication of virus in vitro and in vivo［J］．PLoS ONE，2011;6(2):e16546．

3 de Zoeten E F，Wang L，Butler K et al．Histone deacetylase 6 and heat shock protein 90 control the functions of Foxp3+T-regulatory cells［J］．Mol Cell Biol，2011;31(10):2066-2078．

4 Prakken B J，Wendling U，van der Zee R et al．Induction of IL-10 and inhibition of experimental arthritis are specific features of microbial heat shock proteins that are absent for other evolutionarily conserved immunodominant proteins［J］．J Immunol，2001;167(8):4147-4153．

5 Segal S，Tzehoval E，Feldman M．Immunological tolerance:highdose antigen-induced suppressor cells from tolerant animals inactivate antigen-presenting macrophages［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1979;76(5):2405-2409．

6 Wang X，Zhou S，Chi Y et al．CD4+CD25+Treg induction by an HSP60-derived peptide SJMHE1 from Schistosoma japonicum is TLR2 dependent［J］．Eur J Immunol，2009;39(11):3052-3065．

7 Liu Z，Li X，Qiu L，Zhang X et al．Treg suppress CTL responses upon immunization with HSP gp96 ［J］．Eur J Immunol，2009;39(11):3110-3120．

8 D'Alise A M，Auyeung V，Feuerer M et al．The defect in T-cell regulation in NOD mice is an effect on the T-cell effectors［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2008;105(50):19857-19862．