CHIA和CHI3L1基因變異與漢族兒童哮喘發病的關系①

黃 湘 譚家余 袁春雷 周 濤 羅雅玲

(南方醫科大學附屬中山市博愛醫院產前診斷中心，中山528402)

CHIA和 CHI3L1基因編碼產物 AMCase和YKL-40蛋白是近幾年發現的幾丁質酶和類幾丁質酶之一。幾丁質(Chitin)又名殼多糖，是存在于真菌細胞壁、蠕蟲微絲蚴鞘以及昆蟲和介蟲的外骨骼中，是一種由N-乙酰-D-葡萄糖胺以β1-4糖苷鍵連接而成的線性多糖。幾丁質酶能催化幾丁質中β1-4糖苷鍵的水解，有助于上述有機體的結構重塑，并能提供重要的能量來源。研究顯示AMCase和YKL-40 蛋白在哮喘中表達增加［1，2］，進一步研究發現，其對應編碼基因CHIA和CHI3L1的單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)可能與哮喘的易感性有關，但國內相關報道甚少。本研究采用全新技術MassARRAY-IPLEX技術和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜平臺來探討CHIA和CHI3L1基因的SNPs是否與哮喘的易感性有關，為它們在哮喘中的作用機制研究打下基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 臨床資料 按照中華醫學會呼吸病分會哮喘學組制定的哮喘診斷標準［3］，選取2010年8月～2012年2月年確診的中山市漢族兒童支氣管哮喘患者為研究對象，無其它慢性疾病史。對照組選自同期健康查體者，均無哮喘和過敏性鼻炎史、個人及家族過敏史。所有受檢者相互間無血緣關系，抽血前簽署知情同意書，填寫一般資料調查表，并采集空腹外周血2 ml。

1．1．2 試劑和儀器 DNA提取試劑盒(天根生物技術有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit);低溫超速離心機(Harris);SpectroCHIP芯片(Sequenom);基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(Spectro-READER，Sequenom)。

1．2 方法

1．2．1 基因組 DNA提取 用 TIANamp Genomic DNA Kit提取外周血DNA，按說明書操作，DNA保存于－70℃備用。

1．2．2 位點選擇和引物設計 選取CHIA基因的rs10494132和CHI3L1的rs946263位點為研究靶點。采用Sequenom公司的軟件Assay Design 3．1進行引物設計并由上海英駿生物公司(Invitrogen)合成，其中針對rs10494132特異性擴增的引物為5'-ACGTTGGATGTTAAGATCATCGAGCCTAGC-3'和5'-ACGTTGGATGAGATGCTGAGTCAAGTTCCC-3'，單堿基延伸的引物為5'-AGCCTAGCATTCCATGA-3'。針對rs946263特異性擴增的引物為5'-ACGTTGGATGGATCCCTGACTTTTGCTCTG-3'和5'-ACGTTGGATGTCATGGTGGAAAACAGCAAC-3'，單堿基延伸的引物為5'-GCTGAAGTCTGAGGATACG-3'。

1．2．3 SNPs檢測［4］提取純化后的基因組 DNA樣品定量稀釋，按設計順序加樣于384孔板上，然后添加PCR擴增體系使反應物的終濃度如下:0．1 U的Taq聚合酶，5 ng基因組 DNA，各 2．5 pmol的PCR引物，2．5 mmol的 dNTP。PCR反應條件為:95℃ 15分鐘，然后45個循環的95℃ 20秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒。剩余的dNTP經添加0．3 U的堿性磷酸酶去除。單堿基延伸過程通過添加5．4 pmol的各延伸引物，50 μmol的 dNTP/ddNTP 混合物，0．5 U的 Thermosequenase DNA聚合酶，反應條件為94℃ 2分鐘，然后40個循環的 94℃ 5秒，50℃ 5秒，72℃ 5秒。反應產物用樹脂脫鹽后經自動點樣儀點樣于SpectroCHIP(Sequenom)芯片。點制后的芯片用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜(SpectroREADER，Sequenom)檢測。

1．3 統計學處理 分別統計病例組和對照組基因型分布頻率，經 Hardy-Weinberg平衡檢驗后，用SPSS13．0軟件包進行分析，計數資料間的比較采用χ2檢驗，非正態分布計量資料采用Mann-Whitney U檢驗。P＜0．05具有統計學意義。

2 結果

2．1 一般資料 哮喘患者和同期健康查體者均來自廣東省中山市漢族兒童。入選哮喘組患者共158例，其中男104例，女54例，年齡(46．23±39．62)月。對照組共198例，其中男128例，女70例，年齡(46．23 ±39．62)月。兩組間性別(χ2=0．054，P=0．817)和年齡(t= － 0．313，P=0．754)無明顯差異。

2．2 rs10494132和rs946263位點的基因型特征質譜圖 rs10494132位點的CT基因型在C和T等位基因處均有峰，CC、TT基因型分別在C、T等位基因處都有峰(如圖1)。rs946263位點AG基因型在A和G等位基因處均有峰，AA基因型在A等位基因處有峰，圖中未顯示GG基因型。Haploview4．1軟件分析結果顯示rs10494132和rs946263的SNPs在病例組和對照組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P＞0．05)。基因分型成功率100%。

2．3 rs10494132和rs946263基因多態性與哮喘易感性的關系 與正常對照相比，哮喘組rs10494132的基因型分布(χ2=8．767，P=0．012)和等位基因分布(χ2=9.749，P=0．002)均具有明顯差異(表1)，而 rs946263 基因型分布(χ2=0．472，P=0．790)和等位基因分布(χ2=0．013，P=0．910)均無顯著性差異(表2)。如表3，與 CC+CT基因型相比，rs10494132的TT基因型能顯著增加哮喘發生的危險性，OR值(95%可信區間)分別為2．093(1．252～3．498)。

2．4 rs10494132位點對嗜酸性粒細胞計數和IgE的影響 如表4，在哮喘組中，與CC+CT基因型亞組相比，rs10494132的TT基因型亞組IgE濃度(Z=－2．013，P=0．044)明顯增高，而嗜酸性粒細胞計數(Z= －0．704，P=0．482)和 CRP(Z= －0．488，P=0．626)無明顯變化。

圖1 rs10494132和rs946263位點的基因型特征質譜圖Fig．1 The genotype characteristic mass spectrum of rs10494132 and rs946263

表1 rs10494132多態性和與哮喘易感性的關系［n(%)］Tab．1 The relationship between rs10494132 polymorphism and asthma susceptibility［n(%)］

表2 rs946263多態性和與哮喘易感性的關系［n(%)］Tab．2 The relationship between rs946263 polymorphism and asthma susceptibility［n(%)］

表3 rs10494132與發生哮喘風險的關聯分析Tab．3 Association analysis between rs10494132 and asthma risk

表4 rs10494132與嗜酸性粒細胞計數和IgE的關系Tab．4 The relationship between rs10494132 and eosinophil cell count and IgE

表5 rs10494132位點與哮喘規則治療前病情嚴重程度分級的關系Tab．5 The relationship between rs10494132 and the grade of the severity of initially diagnosed asthma before regular treatment

2．5 rs10494132位點與哮喘初次確診規則治療前病情嚴重程度分級的關系 如表5，rs10494132位點的基因型分布在哮喘初次確診規則治療前不同病情嚴重程度分級之間未見明顯差異(χ2=0．719，P=0．397)。

3 討論

CHIA 基因位于染色體 1p13．1-p21．3，又名:AMCASE等。其編碼蛋白AMCase可促進Th2介導的炎癥反應［5］，還可以促進IL-13的表達。在哮喘患者中AMCase表達量明顯增高，運用特異性抑制劑可以減輕患者的炎癥反應［1］。Heinzmann 等［6］研究顯示CHIA的基因變異與疾病有關，單倍型為基礎的關聯分析顯示AMCase與IL-4或IL-13具有協同作用。Birben等［7］通過對CHIA基因啟動子和外顯子1和2區進行測序，發現5'UTR區域的一個10個堿基對插入可能改變基因的表達和肺功能。在高加索人群中［8］，COPD患者的FEV1在rs3818822位點的AA和GG基因型兩組中具有顯著性差異。與AA純合子相比，GG基因型患者AMCase蛋白和幾丁質酶的活性較高。Leung等［9］認為CHIA與兒童濕疹有關。有報道CHIA基因的一個外顯子變異(rs3818822)與德國兒童哮喘有關［10］。Chatterjee等［11］在印度人群中發現rs3806448基因多態性與過敏性哮喘以及血清總IgE水平具有顯著相關性。此外rs2282290也與過敏性哮喘相關，而rs10494132多態性與血清總 IgE相關。Chatterjee等［11］認為rs10494132的SNPs改變了CHIA啟動子的轉錄活性，C變成T八聚體轉錄因子-1結合位點失去作用。而Wu等［12］的研究則認為CHIA多態性與哮喘無關(含RS10494132)。從上述系列研究可以看出CHIA基因的SNPs可能參與基因表達和功能的調節，可作為哮喘的一個易感因素，但結論不完全相同，國內在兒童哮喘中尚缺乏這方面大樣本的研究。本研究初步顯示，與正常對照相比，哮喘組rs10494132的基因型分布和等位基因分布均具有明顯差異。與CC+CT基因型相比，rs10494132的TT基因型能顯著增加哮喘發生的危險性，OR值(95%可信區間)分別為 2．093(1．252 ～3．498)。在哮喘組中，與 CC+CT基因型亞組相比，rs10494132的TT基因型亞組IgE濃度明顯增高。提示rs10494132與哮喘的發病有關并影響血清IgE濃度。

CHI3L1基因位于染色體1q31-q32，其基因編碼產物是YKL-40。YKL-40由激活的中性粒細胞和巨噬細胞分泌，具有多種生理功能。而CHI3L1的基因變異也與疾病有關，Lee等［13］使用YKL-40的轉基因小鼠作為研究對象，發現缺少YKL-40基因的小鼠Th2炎癥反應及IL-13介導炎癥反應和組織修復都明顯受到抑制。在基因多態性研究中，與哮喘發病關系比較明確而且報道比較多的位點是rs4950928，Cunningham［14］發現 CHI3L1 的 rs4950928的多態性與兒童和年輕人哮喘有關。Ober等［2］報道rs4950928不僅與血清YKL-40的水平有關，而且與哮喘及肺功能具有相關性。同時Sohn等［15］發現CHI3L1的rs10399805和rs2275353均與變態反應性密切相關。但也有相反的結論，Wu等［12］卻發現，在輕到中度哮喘的患者中，CHI3L1的單核苷酸多態性與哮喘患病率、肺功能的改變以及哮喘表型無關。有研究顯示rs946263與CHI3L1的表達水平有關，在兒童哮喘的研究中，發現rs946263與rs4950928位點呈強連鎖不平衡，影響CHI3L1的轉錄水平［14］。Lin等［16］也證實 CHI3L1的 rs946263和 NPPA 的rs5065位點存在著一種所謂的觸發器關系，但無論是生理上和臨床上，目前這種關系的意義還不清楚。而含有rs5065位點C等位基因的人群的哮喘危險性下降，提示NPPA的基因多態性與哮喘有關［17］。那么rs946263是否直接與哮喘有關呢?國內外尚沒有見到相關報道，我們的初步研究發現，rs946263與中山市兒童哮喘的易感性無關。

本研究利用MassARRAY-IPLEX技術和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜平臺對SNPs進行了檢測，節省了時間，保證了結果的準確性，且分型成功率達到100%。但樣本量相對較小，相關結論有待于大樣本和多人群的進一步驗證。

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