甘草酸苷體外上調(diào)乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者免疫功能①

李旭華 陳 月 吳文苑 陳茳晶 金紅濤

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，深圳518020)

乙型肝炎疫苗是當(dāng)今預(yù)防乙型肝炎的主要方法，但正常人按標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行一個(gè)免疫程序后，仍有5%～10%的抗體滴度不能達(dá)到保護(hù)性閾值(抗-HBs＜10 U/L)，即無(wú)、弱應(yīng)答者，成為 HBV易感者［1］。乙肝疫苗無(wú)(弱)應(yīng)答的發(fā)生受多種因素的影響，其確切機(jī)制目前仍不十分清楚。近年有研究人員嘗試用黃芪多糖和高分子聚合物作佐劑來(lái)提高乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者的應(yīng)答率，但效果不一，且副作用未知。甘草酸苷(Glycyrrhizin，GL)為甘草中的主要成分，是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，且人體吸收良好。本文通過(guò)體外研究GL和HBsAg聯(lián)合應(yīng)用對(duì)乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10)和 共 刺 激 分 子 B7(CD80、CD86)mRNA表達(dá)水平的影響，并觀察其刺激誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞(DC)可否促進(jìn)同種異體淋巴細(xì)胞增殖和提高CTL的殺傷活性，探討GL對(duì)乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象 選擇我院體檢的乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者50例為無(wú)應(yīng)答組，年齡18～45歲，其中男性27例，女性23例，均為常規(guī)0、1、6三針接種乙肝基因工程疫苗，于第三針接種后一個(gè)月檢測(cè)乙肝兩對(duì)半結(jié)果全陰，而后加強(qiáng)一針后一個(gè)月檢測(cè)仍為五項(xiàng)全陰者。應(yīng)答組50例為接種乙肝疫苗后HBsAb檢測(cè)陽(yáng)性(＞100 U/L)的健康人群。各組均于接種最后一針疫苗一個(gè)月后采血。全部研究對(duì)象均排除HAV、HCV和HBV-DNA(+)隱性感染及心腦腎和其他器官疾病。

1．2 主要儀器及試劑 熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)(Eppendorf公司)，電泳儀(瑞士 AMERSHAM公司)，凝膠成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，RNA提取試劑 Trizol(Invitrogen公司)，RT-PCR和 SYBR Green Real-time PCR試劑盒(Takara公司)，淋巴細(xì)胞分離液(北京鼎國(guó)生物公司)，rhGM-CSF、rhIL-4(Pepro-Tech公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，甘草酸苷(日本米諾發(fā)源制藥株式會(huì)社)，HBsAg(大連高新生物制藥有限公司)，引物設(shè)計(jì)使用Primer5．0，由Invitrogen公司合成(見表1)。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 PBMC的獲取 取研究對(duì)象的外周血，肝素抗凝后，與等量的RPMI1640混勻，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離PBMC;臺(tái)盼藍(lán)染色，證實(shí)活細(xì)胞達(dá)95%以上;用PBS洗去血小板，然后再用含10%人AB血清的RPMI1640懸浮PBMC。

1．3．2 Real-time PCR分析細(xì)胞因子和共刺激分子的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組:(1)應(yīng)答組:乙肝疫苗應(yīng)答者PBMC+HBsAg;(2)GL+HBsAg+無(wú)應(yīng)答組:乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者PBMC+HBsAg+GL;(3)HBsAg+無(wú)應(yīng)答組:乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者PBMC+HBsAg;(4)GL+無(wú)應(yīng)答組:乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者PBMC+GL。前三組均給予5 μg/ml終濃度的 HBsAg刺激，GL+HBsAg刺激組同時(shí)給予終濃度10 μg/ml的GL刺激，第四組只給予終濃度10 μg/ml的GL刺激，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞至1.5 ml的 EP管中。每管分別加入1 ml Trizol，氯仿/異丙醇法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的cDNA在ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體系25 μl。Real-time PCR擴(kuò)增條件為95℃30秒預(yù)變性，95℃變性5秒，60℃退火和延伸34秒，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)無(wú)模板對(duì)照。將IFN-γ、IL-4、IL-10、CD80 和 CD86 的 mRNA 與 GAPDH的(Ct值)換算為基因的相對(duì)表達(dá)量2-△△Ct，將正常對(duì)照組歸一化處理，比較各組間的表達(dá)差異。

1．3．3 DC的誘導(dǎo) 取研究對(duì)象的PBMC(濃度為2 ×106ml－1)，加入6 孔板(2 ml/孔)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫育2小時(shí)后分別收集貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組分為乙肝疫苗應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組。應(yīng)答組:加入 rhGM-CSF 100 μg/L 和 rhIL-4 100 μg/L 刺激，于第5天加入HBsAg(5 μg/ml);無(wú)應(yīng)答組分為2組，組1為常規(guī)誘導(dǎo)組:加入rhGM-CSF 100 μg/L和rhIL-4 100 μg/L培養(yǎng)8天;組2再分①、②、③三組:每組均加入 rhGM-CSF 100 μg/L和 rhIL-4 100 μg/L，培養(yǎng)第5天再按分組加入不同刺激物，①組:HBsAg(5 μg/ml);②組:HBsAg(5 μg/ml)+GL(10μg/ml);③組:GL(10 μg/ml)。隔天半量換液并補(bǔ)充細(xì)胞因子，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量及形態(tài)變化，第8天可見細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，體積增大，偽足樣、樹枝狀突起增多、變長(zhǎng)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Tab．1 Primers used to perform Real-time PCR

1．3．4 同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 取乙肝疫苗應(yīng)答者的 PBMC，37℃、5%CO2培養(yǎng)2小時(shí)后收集非貼壁的淋巴細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106ml－1作效應(yīng)細(xì)胞。取1．3．3中各組誘導(dǎo)的 DC，加入 25 μg/ml絲裂霉素C去除增殖作用并調(diào)整密度為1×105ml－1作刺激細(xì)胞，依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定1∶20為DC與異體淋巴細(xì)胞最適比例，對(duì)照孔不加DC，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育72小時(shí)，加入 CCK-8溶液10 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，測(cè)OD450值，結(jié)果以3孔均值表示。刺激指數(shù)(SI)=實(shí)驗(yàn)孔OD450/對(duì)照組OD450。

1．3．5 細(xì)胞殺傷活性測(cè)定 取1．3．3中誘導(dǎo)的各組DC分別加自體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)7天誘導(dǎo)出CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，同時(shí)設(shè)對(duì)照組為單純自體淋巴細(xì)胞。取傳代后24小時(shí)的K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104ml－1。效應(yīng)細(xì)胞濃度分別調(diào)整為2．5 × 105、5 × 105、1 × 106ml－1，效靶比依次為5∶1、10∶1、20∶1。置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 48小時(shí)，加入 CCK-8溶液10 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，測(cè)OD450nm值，結(jié)果以3孔均值表示。

細(xì)胞殺傷率(%)=(單純效應(yīng)細(xì)胞孔的OD450值+單純靶細(xì)胞孔的OD450值－細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)孔的OD450值)/單純靶細(xì)胞孔的OD450值×100%。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用SPSS18．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以±s表示，多組間統(tǒng)計(jì)分析采用F分析和多因素的方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 GL對(duì)乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者PBMC細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響 如圖1所示，HBsAg+GL+無(wú)應(yīng)答組PBMC的IFN-γ、IL-4 mRNA表達(dá)水平低于應(yīng)答組(P＜0．05)，IL-10 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0．05);但與HBsAg+無(wú)應(yīng)答組比較，HBsAg+GL+無(wú)應(yīng)答組和GL+無(wú)應(yīng)答組PBMC的IFN-γ、IL-10 mRNA表達(dá)水平均明顯提高(P＜0．05)，且后者低于前者(P＜0．05);而IL-4 mRNA變化在無(wú)應(yīng)答者的三組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

2．2 GL對(duì)乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者PBMC共刺激分子mRNA表達(dá)的影響 如圖2所示，HBsAg+GL+無(wú)應(yīng)答組PBMC的CD80和CD86 mRNA表達(dá)水平都顯著高于HBsAg+無(wú)應(yīng)答組和GL+無(wú)應(yīng)答組(P＜0．05)，但CD80 mRNA與應(yīng)答組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，而CD86 mRNA強(qiáng)于應(yīng)答組;此外，GL+無(wú)應(yīng)答組CD80、CD86 mRNA的表達(dá)水平皆高于HBsAg+無(wú)應(yīng)答組(P＜0．05)。

2．3 GL對(duì)乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者同種異體淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響 如圖3所示，各實(shí)驗(yàn)組DC都能有效地刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖，其中實(shí)驗(yàn)組②的DC刺激淋巴細(xì)胞增殖的作用明顯高于其他各組(P＜0．05);另外，實(shí)驗(yàn)組③的DC對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的刺激作用強(qiáng)于實(shí)驗(yàn)組①(P＜0．05)，但低于應(yīng)答組(P＜0．05);實(shí)驗(yàn)組 ①與常規(guī)誘導(dǎo)組比較無(wú)顯著差異(P ＞0．05)。

圖1 不同組 PBMC的IFN-γ、IL-4、IL-10 mRNA 表達(dá)的相對(duì)量(n=3)Fig．1 The expression of IFN-γ，IL-4，IL-10 mRNA in PBMC of different groups(n=3)

圖2 不同組PBMC的CD80、CD86 mRNA表達(dá)的相對(duì)量(n=3)Fig．2 The expression of CD80，CD86 mRNA in PBMC of different groups(n=3)

2．4 GL對(duì)乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者CTL殺傷活性的影響 見表2，與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組CTL對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性均有提高，其中實(shí)驗(yàn)組②的CTL殺傷活性明顯高于實(shí)驗(yàn)組①和③(P＜0．05)，且隨著效靶比升高而增強(qiáng)，與應(yīng)答組比較無(wú)明顯差異(P＞0．05);此外，實(shí)驗(yàn)組③的CTL殺傷活性高于實(shí)驗(yàn)組①(P ＜0．05)。

圖3 不同實(shí)驗(yàn)組DC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力(n=3)Fig．3 the proliferation of allogenetic T cell with different experimental groups(n=3)

表2 不同實(shí)驗(yàn)組CTL對(duì)K562細(xì)胞殺傷率(%，x ± s，n=3)Tab．2 Killing effects on K562 cell with different experimental groups(%，x ± s，n=3)

3 討論

GL是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑。有學(xué)者嘗試?yán)闷涿庖哒{(diào)節(jié)功能治療潰瘍性結(jié)腸炎、斑禿等免疫失衡引起的疾病，均取得了良好的效果［2，3］。現(xiàn)已證實(shí)GL治療慢性乙型肝炎具有一定的優(yōu)勢(shì)且療效確定，認(rèn)為可打破機(jī)體免疫耐受或低下狀態(tài)，影響抗-HBs出現(xiàn)的時(shí)間和滴度，甚至有學(xué)者嘗試用于SARS和H5N1型禽流感的治療以及抗腫瘤藥物的保護(hù)劑，均取得了顯著的療效［4，5］。但其與乙肝疫苗無(wú)(弱)應(yīng)答的關(guān)系方面鮮有報(bào)道。因此，本文研究觀察了GL與乙肝疫苗聯(lián)合應(yīng)用可否誘導(dǎo)機(jī)體選擇性地增強(qiáng)和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，從而有效地提高機(jī)體對(duì)乙肝疫苗的應(yīng)答能力。

近年研究發(fā)現(xiàn)，GL并非單純地影響某一種或幾種細(xì)胞因子的升高或降低，而是可以打破機(jī)體Th1和Th2類細(xì)胞因子的失衡狀態(tài)，對(duì)于機(jī)體免疫功能失調(diào)的修正意義重大［6］。乙肝疫苗無(wú)(弱)應(yīng)答機(jī)制主要與機(jī)體免疫功能不完善有關(guān)，無(wú)(弱)應(yīng)答者體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞因子分泌水平變化而導(dǎo)致的機(jī)體免疫狀態(tài)失衡是保護(hù)性抗體不能產(chǎn)生的重要因素［7］。本文研究結(jié)果顯示，HBsAg+GL聯(lián)合刺激可顯著提高無(wú)應(yīng)答者IFN-γ、IL-10 mRNA表達(dá)水平，尤其是IL-10 mRNA可達(dá)到應(yīng)答組水平。已證實(shí)IFN-γ是典型的Th1細(xì)胞因子，對(duì)被稱為T細(xì)胞分化因子的IL-2具有促進(jìn)作用，其缺乏意味著機(jī)體對(duì)抗原特異性的無(wú)能。IL-10最初認(rèn)為是一種Th2細(xì)胞因子，然而新近研究發(fā)現(xiàn)［8］，Th1細(xì)胞在IL-12的輔助下亦可分泌IL-10，其增加在維持Th1/Th2細(xì)胞因子平衡中發(fā)揮了重要的作用，提高機(jī)體的體液免疫水平，還可以抑制IL-4產(chǎn)生，提示GL可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子影響機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程，對(duì)于機(jī)體產(chǎn)生達(dá)到保護(hù)作用的抗體具有積極的促進(jìn)作用。IL-4主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，抑制Th1細(xì)胞增殖及其應(yīng)答。在本研究中，IL-4的表達(dá)并未有明顯變化，推測(cè)與GL對(duì)Th1類細(xì)胞因子影響作用更大有關(guān)。

機(jī)體對(duì)疫苗應(yīng)答產(chǎn)生足量的保護(hù)性抗體，是一個(gè)復(fù)雜的免疫反應(yīng)過(guò)程。目前，國(guó)內(nèi)外推廣使用的乙肝表面抗原疫苗是嚴(yán)格的胸腺依賴抗原，易誘導(dǎo)免疫耐受。研究認(rèn)為，共刺激分子 B7(CD80、CD86)及其配體CD28結(jié)合是特異性免疫應(yīng)答發(fā)生的重要因素，在防止形成免疫耐受方面起關(guān)健作用，其表達(dá)不足會(huì)直接影響乙肝疫苗誘導(dǎo)抗-HBs形成［9］。本文研究結(jié)果顯示，與HBsAg單獨(dú)刺激組比較，HBsAg+GL聯(lián)合刺激組CD80、CD86 mRNA表達(dá)水平明顯提高，尤其是CD86 mRNA表達(dá)水平甚至超過(guò)應(yīng)答組水平，說(shuō)明GL對(duì)于機(jī)體產(chǎn)生足夠強(qiáng)度的免疫應(yīng)答具有積極地促進(jìn)作用。

DC是唯一能夠刺激初始T細(xì)胞活化的APC，成熟DC具有豐富共刺激信號(hào)及其他黏附分子表達(dá)，同時(shí)分泌多種細(xì)胞因子，有利于激活其他免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)出高效的免疫效應(yīng)。Overton［10］證實(shí):接種時(shí)加入GM-CSF佐劑并不能有效提高抗體滴度。Akbar等［11］利用HBsAg刺激強(qiáng)應(yīng)答者DC后輸入無(wú)應(yīng)答者體內(nèi)雖然產(chǎn)生一定的效果，但不甚理想，且異體DC的免疫原性問(wèn)題有待解決。Hua等［12］新近報(bào)道，純化的GL可誘導(dǎo)鼠DC表型和功能成熟，增強(qiáng)CD86、CD40、CD80、CD83 和 MHC II表達(dá)，并促進(jìn)IL-12、IL-10分泌而降低TNF-α產(chǎn)生。本文研究結(jié)果顯示，GL+HBsAg聯(lián)合刺激組DC促進(jìn)同種異體淋巴細(xì)胞增殖的效應(yīng)顯著，且強(qiáng)于應(yīng)答組，提示GL可促進(jìn)DC成熟從而增強(qiáng)乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者免疫功能。此外，研究還發(fā)現(xiàn)在HBV隱匿性感染兒童(乙肝DNA定量仍為陰性)中，大部分接種乙肝疫苗后產(chǎn)生的抗體滴度都不能達(dá)到保護(hù)水平，認(rèn)為隱匿性感染導(dǎo)致的免疫耐受是乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答的主要原因［13］。本文結(jié)果顯示，GL+HBsAg聯(lián)合刺激組CTL的細(xì)胞殺傷活性顯著提高，與應(yīng)答組比較無(wú)明顯差異，且殺傷作用隨效靶比的升高而增強(qiáng)，也表明GL這種佐劑作用具有潛在的治療價(jià)值。同時(shí)由于CTL活性增強(qiáng)，分泌IFN-γ，激活巨噬細(xì)胞及誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞表達(dá)MHC分子等能力都大大增強(qiáng)，使得低通量病毒感染引起的對(duì)乙肝疫苗免疫耐受的這一漏洞有望改善。

根據(jù)免疫學(xué)的研究結(jié)果，如何提高機(jī)體對(duì)乙肝疫苗的應(yīng)答能力是一個(gè)重要而長(zhǎng)期的研究課題。我們的研究結(jié)果表明，GL可使機(jī)體的免疫狀態(tài)向Th1方向漂移，能促進(jìn)DC成熟，使得乙肝疫苗無(wú)(弱)應(yīng)答者抗原提呈這一薄弱環(huán)節(jié)得到加強(qiáng)，從而打破其體內(nèi)的免疫異常狀態(tài)。因此，雖然體內(nèi)效應(yīng)有待進(jìn)一步研究，GL仍有望成為一種潛在的有前途的疫苗佐劑用于提高乙肝疫苗接種人群的應(yīng)答率。

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