花旗松素、槲皮素對LPS誘導流產小鼠子宮巨噬細胞的抑制作用①

賈永芳 吳雷振 張瑞平 王麗霞 劉亞潔 張順利

(河南師范大學生命科學學院 省部共建細胞分化調控國家重點實驗室，新鄉453007)

花旗松素和槲皮素專屬性強，是水紅花子的質量控制標準物，花旗松素是槲皮素的同分異構體，具有調節脂代謝、抗炎、抗氧化、抗輻射、抗病毒和抗腫瘤活性作用［1］。本研究團隊已經發現水紅花子水煎劑對LPS所致小鼠流產具有保胎作用，但其單體活性成分是否也具有類似的抗感染流產作用及其作用機制目前尚不清楚。而在由細菌感染引起的流產中，細菌脂多糖(LPS)起關鍵作用，它可以通過激活子宮巨噬細胞釋放 TNF-α，而導致流產［2，3］。同時CD14是巨噬細胞重要的模式識別受體，又是介導LPS激活巨噬細胞的受體，在清除LPS過程中發揮重要作用［4］。本實驗旨在通過觀察花旗松素、槲皮素對LPS誘導流產小鼠子宮中非特異性酯酶陽性巨噬細胞和CD14陽性巨噬細胞數量和分布，分泌TNF-α含量的變化，從細胞、分子水平上闡明花旗松素和槲皮素的免疫抑制作用，從免疫藥理學角度探討其保胎機理，為其藥效的進一步開發和尋找抗感染流產的新途徑提供依據。

1 材料與方法

1．1 實驗藥品和器材 花旗松素(Taxifolin)和槲皮素(Quercetin)均購自南京澤朗醫藥有限公司;LPS(Sigma，美國，127k4048)購自北京鼎國生物技術有限公司;兔抗鼠 CD14抗體 (Santa Cruze，美國);生物素化的羊抗兔IgG和辣根過氧化酶標記鏈酶卵白素(Vector，美國);小鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(R＆Dsystems，美國);冰凍切片機(Reichert Histo，美國);酶標儀(ST-360，上海科華實驗系統有限公司);LPS:用0.01 mol/L pH7．4的PBS 配制濃度為0．5 μg/ml的溶液。

1．2 實驗動物 8周齡昆明種清潔級小鼠體重20～22 g，常規飼養，自由取食飲水。以陰道涂片法進行動情周期鑒定。取動情期雌鼠與雄鼠2∶1合籠過夜，次日清晨檢出陰栓者定為孕1天。

1．3 動物分組及處理 孕鼠隨機分為對照組(簡稱A組)和實驗組。實驗組又分為LPS處理流產模型組(簡稱B組)、低濃度花旗松素及LPS雙處理組(簡稱C1組)、高濃度花旗松素及LPS雙處理組(簡稱C2組)、低濃度槲皮素及LPS雙處理組(簡稱D1組)、高濃度槲皮素及LPS雙處理組(簡稱D2組)。每組小鼠15只。A、B組于孕2天開始每天灌胃PBS 0．4 ml，1 次/天;其中，A 組于孕 6 天尾靜脈注射 PBS 0．2 ml;B組于孕 6天尾靜脈注射 LPS 0．2 ml［5，6］;C1 組于孕 2 天開始每天灌胃花旗松素50 mg/kg，連續灌胃至孕8天，其中在孕6天尾靜脈注射LPS 0．2 ml;C2組:孕2天開始灌胃花旗松素250 mg/kg，連續灌至孕8天，其余同C1組;D1組:孕2天開始灌胃槲皮素50 mg/kg，連續灌至孕8天，其余同 C1組;D2組:孕 2天開始灌胃槲皮素250 mg/kg，連續灌至孕8天，其余同C1組。所有小鼠均于孕9天處死取子宮。每只小鼠左側子宮角用于制備冰凍切片，右側子宮角用于ELISA檢測。

1．4 非特異性酯酶染色 左側子宮角冰凍切片，橫切6 μm，晾干。參照文獻［7］進行非特異性酯酶(α-ANE)染色。

1．5 免疫組織化學染色 左側子宮角冰凍切片6 μm，多聚甲醛固定 20分鐘，分別用 0．3% 的H2O2，10%正常羊血清封閉非特異性染色。滴加1∶200兔抗鼠CD14一抗，按試劑盒要求進行免疫組織化學染色，鏡檢、照相。

1．6 子宮組織勻漿液制備和ELISA方法 將右側子宮角置預冷PBS中剝去胚胎，冰浴勻漿，12 000 r/min，4℃離心15分鐘，分裝上清液，－20℃凍存。TNF-α檢測按ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀450 nm處讀取OD值，標準曲線確定TNF-α含量。

1．7 胚胎吸收率計算、細胞計數和統計學分析 胚胎吸收率 =［死亡胚胎數/(死亡胚胎數+正常胚胎數)］×100%。每只動物取5張切片，細胞計數于10×40倍光鏡下，每張切片隨機選取6個視野，用CIS圖像分析軟件測量免疫組化陽性細胞數量、灰度值和陽性面積。數據以±s表示，統計分析采用SPSS13．0軟件和組間t檢驗。

2 結果

2．1 花旗松素和槲皮素對小鼠胚胎發育的影響孕9天解剖孕鼠，A組15只中有2只出現明顯流產跡象，胚胎形態明顯小于正常胚胎，胎盤和胚胎有出血或壞死，呈黑褐色;而正常胚胎大小均勻，呈粉紅色。B組孕鼠全部流產，胚胎吸收率100%，胎盤壞死，子宮內嚴重淤血，造模成功。C1、C2和D1組流產率和胚胎吸收率均略高于A組(P＞0．05)，D2組流產率較A組略有增加，胚胎吸收率顯著高于A組(P＜0．01);各雙處理組流產率與B組相比下降，胚胎吸收率極顯著降低(P＜0．01)。結果詳見表1。

2．2 花旗松素和槲皮素對小鼠子宮α-NAE+巨噬細胞的影響

2．2．1 花旗松素和槲皮素對小鼠子宮α-NAE+巨噬細胞數量和分布的影響 B組小鼠子宮內膜和肌層α-NAE+巨噬細胞數量均顯著多于A組(P＜0.01，圖1A、B);C1組與A組相比，外膜巨噬細胞顯著減少(P＜0．05)，但內膜及肌層已接近 A組(P＞0．05，圖1C)。C2組與 A組、B組相比，子宮各層 α-NAE+巨噬細胞數量均顯著減少(P＜0.05)，內膜和肌層達到極顯著水平(P＜0．01)。D1組與A組相比，外膜顯著降低(P＜0．05)，其他部位差異不顯著;三層組織結構中巨噬細胞均顯著低于B組(P＜0．05)。D2組子宮內膜和肌層巨噬細胞數目顯著高于A組，低于B組(P＜0．01)。詳見表2。

2．2．2 花旗松素和槲皮素對小鼠子宮α-NAE+巨噬細胞灰度值的影響 與A組相比，B組子宮內膜和肌層灰度值顯著減少(P＜0.05)，外膜灰度值與A組無差異;D2組肌層灰度值顯著降低(P＜0.05);其他雙處理組內膜與肌層和A組相比無顯著差異，外膜較A組顯著增加(P＜0.05)。雙處理組和B組相比均顯著增加(P＜0.05)。詳見表2。

2．2．3 花旗松素和槲皮素對小鼠子宮巨噬細胞α-NAE+陽性反應面積的影響 與A組相比，B組子宮內膜和肌層巨噬細胞α-NAE+陽性反應面積顯著增加(P＜0．01)。C1、D1組內膜和肌層與A組相比差異不顯著，較 B組顯著下降(P＜0．01)。C2組內、外膜陽性面積較A組顯著減少，肌層降低(P＜0．01)。D2組內膜和肌層較A組和其他雙處理組極顯著增加(P＜0．01);內膜較B組極顯著下降(P＜0．01)，肌層下降不顯著。詳見表2。

2．3 花旗松素和槲皮素對小鼠子宮CD14+巨噬的影響

2．3．1 花旗松素和槲皮素對小鼠子宮CD14+巨噬細胞數量和分布的影響 B組小鼠CD14+巨噬細胞數量與A組相比，內膜、肌層均顯著增多(P＜0.01)，外膜與 A 組相似(圖2A、B)。C1組、D1組與A組相比，肌層顯著升高(P＜0．01)，外膜顯著降低(P ＜0．05)，內膜接近 A 組(P ＞0．05，圖 2C)。C2組子宮內膜和外膜CD14+巨噬細胞數量均顯著低于A組，肌層極顯著高于A組 (P＜0．01)。D2組內膜和肌層CD14+巨噬細胞均極顯著高于A組(P＜0．01)，外膜低于 A 組(P ＜0．05)。各雙處理組與B組相比，3層巨噬細胞數量均顯著低于B組(P＜0．05)，內膜和肌層達到極顯著水平(P＜0.01)。詳見表3。

2．3．2 花旗松素和槲皮素對小鼠子宮CD14+巨噬細胞灰度值的影響 B組子宮內膜和肌層CD14+巨噬細胞灰度值較A組顯著減少(P＜0．05)，外膜差異不明顯。C2組內膜和外膜均顯著高于A組(P＜0．05)，肌層無顯著差異。其它各雙處理組內膜和肌層變化與A組近似，顯著高于B組(P＜0.05);外膜較A組和B組顯著增加(P＜0．05)。詳見表3。

2．3．3 花旗松素和槲皮素對小鼠子宮CD14+巨噬細胞免疫反應陽性面積的影響 B組子宮內膜和肌層CD14+巨噬細胞陽性面積率較A組顯著增加(P＜0．01)。D2組肌層極顯著高于A組和其它雙處理組，低于B組(P＜0．01)，內膜和外膜與A組無顯著差異。其他雙處理組3層結構與B組相比均顯著降低，其中內膜和肌層達到極顯著水平(P＜0.01);與A組相比內膜極顯著降低(P＜0．01)，外膜顯著降低(P ＜0．05)，肌層顯著升高(P ＜0．01);組間差異不顯著。詳見表3。

表1 各組小鼠的妊娠結果Tab．1 Pregnancy outcome of each group mice

表2 LPS、花旗松素和槲皮素對各組小鼠子宮α-NAE+巨噬細胞的影響(±s)Tab．2 Effect of LPS，taxifolin and quercetin on the α-NAE+macrophages in the uterine of each group mice(x±s)

表2 LPS、花旗松素和槲皮素對各組小鼠子宮α-NAE+巨噬細胞的影響(±s)Tab．2 Effect of LPS，taxifolin and quercetin on the α-NAE+macrophages in the uterine of each group mice(x±s)

Note:Data with different letters significantly differ(capitals means P ＜0．01，lowercase means P ＜0．05)among treatments．

Quantity Gray value Positive cell area Groups Endometrium Myometrium Perimetrium Endometrium Myometrium Perimetrium Endometrium Myometrium Perimetrium A 6．12 ±0．71A 2．81 ± 0．82A16．54 ±1．67a66．64 ±7．71a70．62 ±1．67a43．76 ±5．44a1．09% ± 0．001 1A0．95% ± 0．001 5A1．86% ±0．004 4a B 26．23 ±2．65B32．84 ±3．33B14．34 ±0．35a45．71 ±2．21b54．61 ±2．23b46．60 ±1．52a3．25% ± 0．008 3B2．87% ± 0．004 4B1．49% ±0．003 8ab C1 6．20 ± 1．18A2．88 ± 0．84A10．40 ±1．14bc64．64 ±7．71a69．56 ±2．14a61．32 ±5．58b0．89% ± 0．001 5A0．75% ± 0．001 9A1．37% ±0．003 1b C2 3．40 ± 0．91C1．40 ± 0．55C 8．24 ± 0．45c68．41 ±1．57a76．13 ±6．64a69．67 ±4．24b0．61% ± 0．001 9C0．51% ±0．002 3C1．32% ±0．003 4b D1 9．44 ± 1．14A2．54 ± 0．83A11．56 ±0．12b63．65 ±11．15a73．15 ±3．05a62．55 ±3．34b1．01% ± 0．002 1A0．88% ±0．001 9A1．48% ±0．002 3ab D2 20．58 ±2．52D16．25 ±3．22D12．75 ±0．15b58．45 ±2．61a61．00 ±3．32c63．75 ±8．91b2．49% ± 0．006 5D2．46% ±0．005 5B1．89% ±0．001 4a

2．4 花旗松素和槲皮素對小鼠子宮TNF-α含量的影響 子宮TNF-α含量(pg/ml;蛋白)在B組含量為45．36 ± 6．89，顯著高于 A 組 25．38 ± 2．89(P＜0．05)。C1 組為 26．23 ± 4．71，C2 組為29．25 ± 0．46，D1 組為 28．15 ± 3．84，D2 組為34.05±3.08，與A組相比無顯著性差異;與B組相比均顯著降低(P＜0．05)。

表3 LPS、花旗松素和槲皮素對小鼠子宮CD14+巨噬細胞的影響(±s)Tab．3 Effect of LPS，taxifolin and quercetin on the CD14+macrophages in the uterine of each group mice(x±s)

表3 LPS、花旗松素和槲皮素對小鼠子宮CD14+巨噬細胞的影響(±s)Tab．3 Effect of LPS，taxifolin and quercetin on the CD14+macrophages in the uterine of each group mice(x±s)

Note:Data with different letters significantly differ(capitals means P ＜0．01，lowercase means P ＜0．05)among treatments．

Quantity Gray value Positive cell area Groups images/BZ_258_233_538_2242_600.pngA 6．41 ±0．89A 1．41 ±0．25A 15．12 ±0．71a82．36 ±4．61a97．15 ±5．38a61．83 ±4．15a2．44% ±0．006 4A0．62% ±0．000 9A2．78% ± 0．005 3a B 23．28 ±3．35B 26．13 ±4．69B 12．67 ±2．36a60．39 ±4．35b64．08 ±4．32b71．13 ±3．89a3．32% ±0．004 8B3．74% ±0．003 8B2．24% ± 0．003 5a C1 7．12 ±0．71A 8．65 ±1．34C 8．03 ±1．64b 89．45 ±2．51a86．54 ±6．65a90．24 ±3．74b1．12% ±0．001 7C1．56% ±0．001 1C1．44% ± 0．003 4b C2 3．25 ±0．46C 7．42 ±0．98C 7．43 ±1．55b120．64 ±23．71c91．13 ±4．08a88．15 ±3．36b1．07% ±0．002 9C1．36% ±0．004 5C1．42% ± 0．002 5b D1 8．62 ±0．84A 8．43 ±1．29C 8．15 ±1．84b 88．67 ±2．56a102．09 ±3．05a94．75 ±2．71b1．24% ±0．002 1C1．61% ±0．001 2C1．51% ± 0．001 6b D2 14．25 ±2．30D 15．82 ±1．26D 9．15 ± 0．58b87．28 ±3．98a88．75 ±4．39a83．29 ±3．75b2．35% ±0．005 3A2．73% ±0．005 1D1．89% ± 0．014 0ab

圖1 流產小鼠子宮非特異性酯酶染色Fig．1 Non-specific esterase staining in the uterine of abortion mice

3 討論

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成成分，可誘發大鼠和小鼠的胚胎吸收［8，9］。王曉丹［5］報道，每只孕鼠在孕7天靜脈注射0．1 μg LPS引起小鼠流產，本課題組在孕6天注射LPS即可引起小鼠全部流產，胚胎吸收率為100%，認為造模成功。而在孕2～8天預先灌胃孕鼠花旗松素或槲皮素，再注射LPS，孕鼠的流產率與流產模型組相比下降，胚胎吸收率極顯著降低(P＜0．01)，說明花旗松素和槲皮素對LPS誘導的小鼠流產具有抑制作用。

圖2 流產小鼠子宮免疫組化染色Fig．2 Immunohistochemistry staining in the uterine of abortion mice

妊娠是一個免疫耐受的過程，小鼠胚胎著床和維持與子宮巨噬細胞的分布變化有關［10］。外源性LPS通過血漿中脂多糖結合蛋白(LBP)轉運至單核/巨噬細胞膜表面，與CD14結合，啟動LPS信號的細胞內轉導［11］，引起預致敏的巨噬細胞釋放TNF-α［3］，后者可直接引起胎盤滋養層細胞的凋亡［12］，導致小鼠流產，提示 CD14是介導 LPS激活巨噬細胞的關鍵因素。本文實驗結果顯示，A組孕9天時，子宮內的CD14+巨噬細胞主要分布在外膜和內膜，在肌層內幾乎沒有分布。B組子宮內膜和肌層的CD14+巨噬細胞數和陽性面積顯著的高于A組，灰度值顯著小于A組，說明在LPS刺激后巨噬細胞CD14分子的表達增多，高表達的CD14分子作為巨噬細胞的重要的模式識別受體進一步介導LPS激活巨噬細胞，促進巨噬細胞釋放大量的TNF-α。同時實驗結果證實，B組小鼠子宮巨噬細胞CD14表達增加的同時伴隨著TNF-α含量顯著升高。B組外膜CD14+巨噬細胞數目與A組無顯著差異，推測LPS有誘導巨噬細胞從子宮外部向子宮內膜遷移的作用，而各雙處理組的內膜、肌層CD14+巨噬細胞數和陽性面積，TNF-α含量均極顯著的低于B組，Daolin Tang［13］用 100 mg/kg 槲皮素處理由 LPS引起的膿毒癥小鼠也發現血清TNF-α也下降顯著(P＜0．05)。提示一定劑量花旗松素和槲皮素對孕鼠的前期處理可以減少巨噬細胞CD14分子的表達，可能通過阻斷LPS-LBP/CD14系統，在一定程度阻斷抗原呈遞，達到減弱LPS對巨噬細胞的激活作用。推測花旗松素和槲皮素對LPS導致的小鼠流產的保護作用與降低巨噬細胞CD14+的表達、巨噬細胞從子宮外向子宮內膜的遷移能力并抑制TNF-α的分泌有關。值得關注的是，用高濃度槲皮素處理的D2組的作用沒有其它雙處理組顯著，尤其是在對內膜巨噬細胞遷移和CD14分子表達的抑制作用較其他雙處理組明顯降低，而高濃度花旗松素對C2組小鼠子宮內膜巨噬細胞CD14分子表達的抑制作用較其他雙處理組明顯增強，證實這種活性單體對LPS誘導流產小鼠子宮巨噬細胞有抑制作用，但其作用效果有差別，劑量是其原因之一。中藥具有雙向調節作用，在一定的劑量范圍內，隨著劑量的增加有的療效會相應提高，有的療效反而下降，甚至顯示出相反的治療作用。此外，除單味藥的劑量對治療功效的影響外，方劑中君臣佐使的配伍及其劑量比例也是中醫處方的關鍵所在，因此，就槲皮素和花旗松素對巨噬細胞的抑制作用的分子機理以及與其他有效活性成分配伍之藥效仍需深入研究，對其作為新型免疫抑制劑提供更詳實的依據。

De等［14］的觀察表明，與子宮腺區相鄰的基蛻膜中，正常妊娠8天很少見到巨噬細胞，本實驗也觀察到相同的結果。實驗結果表明，B組與A組相比，子宮內膜和肌層的α-NAE+巨噬細胞數量和陽性面積都極顯著增加，說明LPS刺激后子宮內巨噬細胞非特異性酯酶的活性顯著增強，使巨噬細胞水解能力增強，吞噬防御功能增強，而在這過程中也會產生大量的炎性細胞因子而導致流產。除D2組肌層外，其他雙處理組子宮內膜和肌層的α-NAE+巨噬細胞數量和陽性面積與B組相比都極顯著減少，說明預先口服不同濃度的花旗松素和槲皮素可以不同程度地阻止α-NAE+巨噬細胞由外膜向內膜遷移，降低非特異性酯酶的活性，從而減弱由巨噬細胞引起的炎癥反應對胚胎的不利影響。

綜上所述，花旗松素和槲皮素對子宮中巨噬細胞的抑制作用可能是通過阻止細胞的遷移、降低其α-NAE+活性和TNF-α的分泌，阻斷LPS-LBP/CD14系統，進而在一定程度阻斷抗原呈遞，從而改變子宮免疫耐受的微環境實現的。

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