無機鹽和蔗糖濃度對白色紫錐菊不定根生長及次生代謝產物積累影響

吳春華，王 淼，宋杭霖，崔錫花

1大連市農業科學研究院，大連 116036;2延邊州農業科學研究院，龍井 133400;3韓國忠北大學尖端園藝研究中心，清州 361-763

藥用植物不定根的培養可以直接快速獲得植物的活性成分，較細胞培養遺傳性穩定，較毛壯根培養更具安全性，是利用生物反應器大規模生產藥用植物次生代謝產物的最佳培養材料［1］。無機鹽和蔗糖是培養基中重要的營養成分，是利用不定根成功生產目標次生代謝產物的首要條件［2］。祝連彩等［3］利用紫松果菊無菌苗誘導了愈傷組織，且分析了總酚含量與多糖含量，Wu等［4］利用高產紫松果菊不定根在500 L氣升式生物反應器中培養的菊苣酸含量是3年生栽培根的3.2倍，但國內外尚未有對白色紫錐菊不定根及其次生代謝產物紫錐菊苷培養的研究報道。

白色紫錐菊(Echinacea pallida)為菊科松果菊屬多年生藥用植物。原產北美，是國際公認的免疫增強劑，目前作為藥物開發的同屬品種還有紫松果菊Echinacea purpurea和狹葉紫錐菊Echinacea an-gustifolia［5］。白色紫錐菊主要含有紫錐菊苷、氯原酸和菊苣酸等咖啡酸衍生物，野生白色紫錐菊根系中紫錐菊苷含量為3～17 mg/g DW，菊苣酸為0.8 mg/g DW，紫錐菊苷是白色紫錐菊重要次生代謝產物，在紫松果菊中含量甚少［6］。紫錐菊苷具有抗腫瘤作用，對肝癌、肺癌、胃腺癌有明顯抑制效果，還具有壯陽、抗衰老和治療糖尿病等作用［5］。白色紫錐菊還含有抗氧化及清除活性自由基功能的酚類和黃酮類物質。

本研究在構建白色紫錐菊不定根液體培養體系的基礎上，考察了無機鹽濃度和蔗糖濃度對不定根生長及其次生代謝產物積累影響，為開發紫錐菊藥品可提供富含紫錐菊苷等咖啡酸衍生物的高品質不定根系，也為其它藥用植物活性成分的工業化生產奠定理論和實踐基礎。

1 材料和方法

1.1 不定根的培養

從加拿大引進的白色紫錐菊種子消毒后接種于MS培養基中，待種子萌發后將子葉接種在不定根誘導培養基MS+IBA1.0 mg/L。誘導的不定根液體懸浮培養在300 mL三角瓶中，裝入100 mL的MS+IBA1 mg/L培養基，pH調至5.8，培養溫度為25±1℃，暗培養，懸浮培養旋轉速度為100 rpm，繼代培養周期是30 d(圖1)。

圖1 白色紫錐菊不定根培養Fig.1 Culturing of E.pallida adventitious roots

1.2 無機鹽濃度對不定根生長及咖啡酸衍生物合成的影響

不定根接種在IBA1mg/L，MS無機鹽濃度分別調至 0.25 MS、0.5 MS、0.75 MS、1.0 MS 的培養基中，考察無機鹽濃度對不定根生長及紫錐菊苷、菊苣酸、氯原酸、總酚類化合物和總黃酮類化合物等有效成分積累的影響。實驗處理及次生代謝含量測定均是3次重復。培養條件與1.1相同。

1.3 蔗糖濃度對不定根生長及咖啡酸衍生物合成的影響

將不定根接種在0.75 MS+IBA1 mg/L，蔗糖濃度分別調至0%、1%、3%、5%、7%的培養基中懸浮培養，考查蔗糖濃度對不定根生長及有效成分含量的影響。培養條件與1.1相同。

1.4 不定根生物量的測定

將培養的不定根取出，用自來水沖洗干凈后再用濾紙吸取表面水分，置于天平進行稱重即為鮮重(FW)。將稱過鮮重的不定根置于60℃烘干箱中烘干兩天，使其干燥至恒重，稱其干重(DW)，并計算其不定根干鮮重%比及生長率，生長率=(收獲的不定根干重-接種量干重)/接種量干重。

1.5 生理活性物質的萃取［4］

稱取磨碎的干燥不定根0.2 g，加入80%的甲醇10 mL，常溫下用磁力攪拌器萃取15 min，離心10 min，提取上清液，殘留物再一次同一方法萃取分離，最后定容至25 mL，用于測定生理活性物質含量。

1.6 總酚含量測定

福林法(Folin and Ciocalteu)測定:將0.1 mL萃取液中加入2.5 mL蒸餾水，再加入0.1 mL福林指示液，等待6 min加入0.5 mL的20%Na2CO3。反應液在常溫下30 min暗反應，用紫外分光光度計760 nm波長下測定其濃度，標準液是Gallic acid。

1.7 總黃酮含量測定

兒茶素(Catechin)標準液法:0.25 mL萃取液加入1.25 mL蒸餾水，加入5%的 NaNO2溶液0.75 mL，6 min 后加入 10%的 AlCl3溶液 0.15 mL，待反應5 min后加入1M 的NaOH溶液0.5 mL，并用蒸餾水定容至2.5 mL，最后用紫外分光光度計510 nm下測定其濃度，標準液是Catechin。

1.8 咖啡酸衍生物含量的測定

HPLC分析:XTerra C18色譜柱(3 mm ×150 mm，3.0 μm);流動相 A(0.1%三氟醋酸水溶液)和B(乙腈);梯度洗脫:0～35 min，90%A;35～42 min，77%A;42 ～52 min，50%A;52 ～54 min，10%A;52 ～60 min，90%A;流速0.3 mL/min;檢測波長330 nm。咖啡酸衍生物各標準品是從ChromaDex會社(Lagu-na Hills，CA，USA)購進，總咖啡酸衍生物含量是各咖啡酸衍生物含量之和。

1.9 統計分析

數據分析通過ANOVA和Duncans multiple range testes(DMRT)正反交實驗，SAS8.1 software(SAS institute Inc.，Cary，NC，USA)進行，數據以表示。

2 結果與分析

2.1 無機鹽濃度對不定根生長及咖啡酸衍生物積累影響

無機鹽含有細胞組成的主要營養物質，因此對植物的生長及次生代謝產物的積累有很大影響。由表1是可知，無機鹽濃度對白色紫錐菊不定根的生長以及酚類和黃酮類積累影響顯著。白色紫錐菊不定根在0.25 MS和0.75 MS之間，隨濃度增加生物量和生長率均增加，但高濃度1 MS培養基中生長量反而下降。當0.75 MS濃度時，不定根生長顯著高于其它處理，此時鮮重為39.18 g/L，干重為3.93 g/L，生長率達4.61。不定根中總酚含量和總黃酮含量也在無機鹽濃度0.75 MS時最高，總酚含量為27.92 mg/g DW，總黃酮含量達13.1 mg/g DW。

表1 無機鹽濃度對不定根生長及酚類、黃酮類代謝產物積累影響Table 1 Effects of MS medium salt strength on adventitious root growth，phenolics and flavonoids content in E.pallida after 30 days of culture

不同無機鹽濃度對不定根中咖啡酸衍生物積累影響見表2。由表2可知，低濃度0.25 MS和高濃度1.0 MS中咖啡酸衍生物含量均較少，0.5 MS和0.75 MS濃度中咖啡酸衍生物含量顯著高于其它處理，其中0.75 MS濃度中總咖啡酸衍生物含量最高，氯原酸含量為3.91 mg/g DW，紫錐菊苷含量為7.36 mg/g DW，菊苣酸含量達4.08 mg/g DW，總咖啡酸衍生物含量達15.35 mg/gDW。對不定根生長以及總酚含量，總黃酮含量，咖啡酸衍生物積累綜合考慮，對白色紫錐菊不定根的培養最適無機鹽濃度是0.75 MS培養基。

表2 無機鹽濃度對不定根培養中咖啡酸衍生物積累影響Table 2 Contents of caffeic acid derivatives in the adventitious roots of E.pallida as affected by MS medium salt strength after 30 days of culture

2.2 蔗糖濃度對不定根生長及咖啡酸衍生物合成的影響

蔗糖是組織培養中提供碳源的重要來源，培養基中蔗糖濃度可改變滲透壓等很多因素。由表3可知，不同蔗糖濃度0%、1%、3%、5%、7%對白色紫錐菊不定根生長及酚類和黃酮類活性物質積累影響顯著。不含碳源的0%濃度培養基中，不定根鮮重和干重均最低，生長率為負值，表明無碳培養基中不定根不能生長，酚類及黃酮量含量也是不足其它處理的1/2。蔗糖濃度在0～5%時，不定根生長及活性物質含量隨蔗糖濃度增加而增加。當蔗糖濃度5%時，不定根生長量及總酚和總黃酮含量顯著高于其它處理，此時不定根鮮重為41.39 g/L，干重達4.61 g/L，生長率為 5.59，總酚含量達 25.62 mg/g DW，總黃酮含量達13.39 mg/g DW。蔗糖濃度提高至7%時，不定根的干重、酚類及黃酮類含量反而比5%處理下降。

表3 蔗糖濃度對不定根生長及酚類、黃酮類代謝產物積累影響Table 3 Effects of sucrose concentration on adventitious root growth，phenolics and flavonoids content in E.pallida after 30 days of culture

不同蔗糖濃度對不定根中咖啡酸衍生物含量的影響見表4。由表4可知，蔗糖濃度在0～5%之間，咖啡酸衍生物含量隨蔗糖濃度增加而提高，無糖培養基中咖啡酸衍生物含量最少，不定根生長最佳5%蔗糖濃度中氯原酸含量達3.79 mg/g DW，紫錐菊苷為7.40 mg/g DW，菊苣酸為3.96 mg/g DW，總咖啡酸衍生物含量達最高值15.15 mg/g DW，是無糖培養基的3～5倍。但蔗糖濃度5%和7%之間各生物指標無顯著差異。以上不定根生長以及總酚含量，總黃酮含量，咖啡酸含量綜合考慮可以看出，對白色紫錐菊的不定根培養最適蔗糖濃度是5%。

表4 蔗糖濃度對離體不定根培養中咖啡酸衍生物積累影響Table 4 Contents of caffeic acid derivatives in the adventitious roots of E.pallida as affected by sucrose concentration after 30 days of culture

3 討論

MS培養基是植物組織培養中應用最為廣泛的培養基之一，其無機鹽濃度較高。無機鹽濃度決定培養基的水分滲透壓，高濃度無機鹽引起培養基內很低的水分滲透壓，植物不能從培養基中正常吸收營養成分和水分，反而低濃度無機鹽含少量營養成分，不利于植物正常生長［7］。本文以通過改變MS無機鹽的含量來考察無機鹽濃度對白色紫錐菊不定根生長及其活性成分積累影響。白色紫錐菊不定根在低濃度0.25 MS和高濃度1.0 MS培養基中不定根生長及咖啡酸衍生物等含量均較少，對白色紫錐菊不定根最適無機鹽濃度是0.75 MS培養基。不同植物對MS無機鹽濃度的要求也不同，柴胡Bupleurum falcatum不定根在1.0 MS培養基中不定根生長及柴胡皂苷sailosaponin積累最好［8］，高麗參不定根生長最適無機鹽濃度是0.5 MS，次生代謝物質人參皂甙積累最適濃度是1.0 MS［1］。貫葉連翹Hypericum perforatum不定根中金絲桃素hypericin積累最適無機鹽濃度是0.5 MS，低濃度0.25 MS和高濃度2.0 MS均抑制不定根生長和金絲桃素的積累［9］，此結果與本實驗結果基本相同。

蔗糖是組織培養中重要的碳源，初始蔗糖含量對植物組織或細胞的生長速率、次生代謝產物的合成影響甚大，低濃度的蔗糖往往難以滿足培養物生長的需要，而高糖引起高滲透壓也會對培養物的生長帶來不利的影響，在植物組織培養中蔗糖初始濃度一般控制在3%～5%。白色紫錐菊不定根在蔗糖濃度0～5%之間，不定根生長及活性物質含量隨蔗糖濃度增加而增加，不定根生長和咖啡酸衍生物等次生代謝產物積累最適蔗糖濃度是5%，當蔗糖濃度提高至7%時，不定根的干重、酚類及黃酮類含量比5%處理反而下降。不定根培養最適蔗糖濃度因培養材料不同而不同:高濃度蔗糖抑制不定根生長的結果在觀葉連翹和狹葉紫錐菊中也報道過［9，10］。觀葉連翹是3%蔗糖最適不定根生長，但5%和7%高濃度蔗糖適合次生代謝產物氯原酸和金絲桃素的合成［9］。高濃度蔗糖提高次生代謝產物含量是因為植物對滲透脅迫的應急反應［7］。

野生白色紫錐菊中紫錐菊苷含量為3～16 mg/g DW，菊苣酸為 0.8 mg/g DW［6］。本實驗不定根中最高紫錐菊苷含量達7.4 mg/g DW，接近野生根系中含量;菊苣酸含量高達3.96 mg/g DW，是野生含量的4.8倍。此外，本實驗還對酚類和黃酮類有效成分的積累也進行了考察，培養的白色紫錐菊不定根中總酚含量達25.62 mg/g DW，總黃酮含量為13.39 mg/g DW。這表明利用白色紫錐菊不定根在生產抗腫瘤作用的紫錐菊苷等咖啡酸衍生物和抗氧化及清除活性自由基功能的酚類和黃酮類物質等方面有很好的前景。本實驗的研究為進一步大規模培養富含紫錐菊苷的高品質白色紫錐菊不定根系，開發紫錐菊藥品和系列保健品奠定了理論和實踐基礎。

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