生精沖劑對白消安致生精障礙大鼠恢復精子發生及其機理的研究

王慶忠，王東方，劉慧蓮，馮道俊，王漢海，郭祖寶

濰坊學院生物與農業工程學院山東省高校“生物化學與分子生物學”重點實驗室，濰坊 261061

精子發生是指從原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCSs)增殖、遷移、分化，一直到發育為成熟精子的整個過程［1，2］。這一過程受到遺傳、激素、生長因子和環境等多種因素的影響［3］。據統計，全球15%的不育人口中，男性不育占50%［4］，70%不育男子的精子常有缺失、稀少、無活力、形態異常等缺陷，但關于引起這些異常的分子機理的研究還較少［5］，導致治療男性不育的困難。白消安(busulfan)對精子發生有損害作用，導致無精子癥或少精子癥。利用白消安制備生精障礙模型動物，已有大量的報道［6］。研究顯示，在少精子癥的治療中，單純的西藥治療效果并不及一些中藥方劑［7，8］。在本研究中，我們根據報道的生精沖劑協定配方［8］，研究其對生精障礙模型大鼠精子發生的影響和作用機理，以便更好的利用中藥資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SD大鼠購于北京維通利華實驗動物中心，合格證號:SCXK-京2002-0003。大鼠在本實驗室飼養適應后，取5～6周幼年雄性大鼠30只隨機分為正常組、藥物組和對照組，每組各10只，體重190±20 g。

1.1.2 主要藥品及試劑

L-谷胺酰胺、青霉素、鏈霉素、葡萄糖、碘化丙啶(propidium iodine，PI)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、多聚甲醛、Tween-20、Triton X-100、DABCO是triethylendianine公司產品;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、白消安等購自 Sigma公司。無菌生理鹽水為北京雙鶴藥業股份有限公司產品。大鼠促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)酶聯免疫吸附分析(enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA)試劑盒、大鼠黃體生成素(luteinizing hormone，LH)ELISA檢測試劑盒和大鼠睪酮(testosterone，T)ELISA檢測試劑盒是生研(上海)生物科技有限公司產品。限制性內切酶、T4連接酶購自Promega公司;TRIzol試劑購自 Gibco公司，superscriptTMIII逆轉錄酶是 Invitrogen公司產品，Tag DNA聚合酶為大連寶生物公司產品。生精沖劑協定處方中的中藥紫河車、黃芪、枸杞子、菟絲子、仙靈脾、龜甲、砂仁、丹參購于同仁堂藥店。中藥在常溫下清洗后，70℃下4 h烘干，混合研磨成粉，過200目篩，包裝后經Co60輻射滅菌。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物處理

正常組的大鼠常規飼養。藥物組和對照組大鼠先制備成生精障礙大鼠，每只大鼠腹腔注射40 mg/kg體重白消安(白消安先以DMSO溶解后，注射前加等量的蒸餾水配制成4.0 mg/mL的濃度，并加溫至35～40 ℃)［9］，1 次/周 ×2。處理 4 ～5 周后，內源性精子發生已經基本消除。此后，藥物組的大鼠給予灌胃生精沖劑16 g/kg·d［8］，對照組大鼠灌胃等量生理鹽水，連續30 d。

1.2.2 性激素水平的ELISA測定

停藥后次日，斷頭處死大鼠取血，1500 rpm離心血液分離血清，用ELISA試劑盒測血清中FSH、LH和T水平。測定過程按說明書進行，主要步驟為:①在酶標包埋板上，分別設空白孔(不加樣品和酶標試劑)、標準孔(加50 μL標準品)和樣品孔(加40 μL樣品稀釋液和10 μL待測樣品)，用封板膜封閉后，37℃瘟育30 min;②去封板膜，棄液體，用1∶30稀釋的洗滌液30 s×5次，涼干;③加50 μL酶標試劑(空白孔除外)，37℃瘟育30 min;④用1∶30稀釋的洗滌液30 s×5次，涼干;⑤加50 μL顯色劑A，再加50 μL顯色劑B，震蕩混勻，37℃避光顯色15 min;⑥加50 μL終止液，孵育15 min后，在酶標儀上于450 nm波長處測定各孔OD值;⑦以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線，通過樣品的OD值查出相應的濃度。

1.2.3 睪丸組織切片與染色觀察

隨機取各組大鼠左側睪丸5只，去睪丸白膜，用Bouin's固定液固定后石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察生精小管形態和精子發生狀態。

1.2.4 基因表達的半定量RT-PCR分析

用TRIzol試劑按說明書提供的方法提取總RNA。用SuperscriptTMIII逆轉錄酶合成cDNA第一鏈，用Tag DNA聚合酶進行PCR擴增反應。所檢測基因是膠質細胞源神經營養因子(Glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)，引物序列為:gdnf(s):5’-GTCGCTAGCATGGGATTCGGGCC-3’;gdnf(a):5’-GAGAAGCTT TCAGATACATCCACACCGTTT-3’(218bp)。G3PDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內參照，G3PDH(s):ACCACAGTCCATGCCCATCAC，G3PDH(a):TCCACCACCCTGTTGCTGTA(450bp)。引物由上海生物工程服務公司合成。

1.2.5 統計分析

實驗數據以平均數±S表示，數據用SPSS10.0軟件進行統計處理，以One-way ANOVA評價組間差異。P＜0.05為差異顯著。

2 實驗結果

2.1 生精沖劑處理提高了大鼠血清FSH、LH和T水平

ELISA測定結果表明，藥物組大鼠血清中FSH、LH和T水平與正常組相比略低，但無顯著差異(P＞0.05)，與對照組相比明顯升高，且差異顯著(P＜0.05)(表 1)。

2.2 睪丸組織切片顯示生精沖劑促進了精子發生過程

在光鏡下觀察各組大鼠的睪丸組織切片，發現正常組大鼠的曲細精管完整，較厚，生精細胞層數多，排列規則，各級生精上皮細胞層次明顯，曲細精管管腔中有長形精子;藥物組大鼠的曲細精管壁較溥，細胞排列不規則，有分化的精原細胞，管腔中沒有長形精子;對照組大鼠的曲細精管不完整，生精細胞少，觀察不到明顯分化的精原細胞。

表1 血清FSH、LH、T的ELISA測定結果(n=5，)Table 1 Results of levels of FSH，LH and T in rat serum detected by ELISA(n=5，)

表1 血清FSH、LH、T的ELISA測定結果(n=5，)Table 1 Results of levels of FSH，LH and T in rat serum detected by ELISA(n=5，)

注:與對照組相比，*表示差異顯著(P﹤0.05);#表示差異不顯著(P﹥0.05)。Note:Compare with control，*represents the difference was remarkable(P ＜0.05);#represents the difference was not remarkable(P ＞0.05).

組別Group FSH level(pg/mL)LH level(pg/mL)T level(ng/mL)正常組 Normal Group 1682.76 ±13.37 1786.36 ±3.45 2.8.046 ±0.29 9 ±0.53藥物組 Drug Group 1676.28 ±11.71*# 1772.15 ±6.46*# 2.73 ±0.31*#對照組 Control Group 1392.94 ±21.58 1296.25 ±12.49 2

圖1 睪丸組織切片的HE染色圖(×200)Fig.1 Tissue slice of the testis tissue by HE staining(×200)

圖2 不同處理大鼠睪丸組織中的GDNF基因的表達Fig.2 The expressions of GNDF in different treatment rat testis analyzed by semi-qualitative RT-PCR

2.3 RT-PCR結果表明生精沖劑促進了GDNF表達

GDNF是促進精原干細胞自我更新、生精細胞增殖和睪丸支持細胞增殖的重要生長因子［9］。對正常組、藥物組和對照組的大鼠睪丸組織中的GDNF基因表達的半定量RT-PCR分析結繩表明，藥物組與正常組無明顯差異，與對照組相比差異顯著。在灌飼生精沖劑1個月后，睪丸支持細胞所分泌的GDNF水平與正常大鼠相近，而對照組的大鼠睪丸中的GDNF表達水平較弱(圖2)。

3 結論與討論

白消安(1，4-丁二醇二甲磺酸酯)主要用于治療慢性粒細胞白血病，還能引起精原干細胞和各級生精細胞的大量凋亡，抑制精原干細胞的自我更新，對睪丸支持細胞促凋亡作用相對較弱，從而造成精子發生障礙，常用于制備生精障礙動物。一般情況下，這種生精障礙在處理后60～90 d時自然恢復［4，6］。生精沖劑的協定配方以補腎填精壯陽為主，對少精無精子癥患者有一定療效。本研究結果表明，生精沖劑能提高血清中FSH、LH和T水平，促進精子發生過程，這種促進作用的可能的機制之一是促進了GDNF的表達。

FSH主要作用于睪丸支持細胞，促進其增殖和分泌多種生長因子，這些生長因子是生精細胞增殖與分化所必需的。LH主要作用于睪丸間質細胞，促進其增殖和分泌睪酮等。睪酮是促進生精細胞分化的主要激素。在生精障礙模型大鼠睪丸中，由于絕大部分的精原干細胞和全部分化的生精細胞被去除，生精作用的恢復源于少量的精原干細胞。因此，睪丸支持細胞分泌的GDNF作用尤其重要。由于生精沖劑提高了FSH水平，促進了支持細胞的增殖和分泌活動，GDNF的表達量增加，從而促進了精原干細胞的增殖;LH水平的升高和T水平的升高是正相關的，也正是由天T的分泌增多，促進了精原干細胞的分化發育，導致精子發生過程的恢復加快。但是，睪丸支持細胞分泌的生長因子種類多，作用復雜，性激素水平的升高對其他生長因子的作用我們沒有涉及，還有待于進一步的研究。

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